李伟宏，田莉，刘俊保

1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064；2.河南省人民医院，河南 郑州 450003

子宫内膜癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且预后不良［1-2］。中药诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤是有效的治疗手段，应用中药治疗肿瘤得到了广泛的关注。莪术油有较好的抗肿瘤、抗炎、抗病毒、细胞凋亡［3-4］等作用；其主要有效成分为莪术酮、莪术二酮等。但关于莪术油对子宫内膜癌细胞的研究报道较少，本研究将探讨莪术油对HEC-1-B细胞的增殖、凋亡及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株和细胞培养HEC-1-B细胞株由上海歌凡生物科技有限公司提供。将细胞培养于DMEM培养基（10%胎牛血清）中，放入5%CO2、37℃培养箱中孵育［10］。

1.2 药品及试剂DMEM培养基（美国康宁公司，批号：C2413118）；标准胎牛血清（standard FBS，天津灏洋生物制品科技责任有限公司，批号：20191230）；四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT，美国Sigma公司，货号：88417）；DMSO（美国Amresco公司，货号：472301）；Hoechst 33258染色剂（美国Sigma公司，货号：BK17520）；Caspase-3、Bax与Bcl-2抗体（美国Cell signaling technology公司，货号分别为：9622、5023、15071）；ECL化学发光液（碧云天生物技术有限公司，货号：P0018AS）；莪术油注射液（徐州莱恩药业有限公司，批号：H20067076）。

1.3 仪器倒置显微镜及照相装置（日本Olympus公司）；CO2培养箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；低速离心机（北京医用离心机厂）；MP200A型电子天平（上海精科天平）；DNM-9602G酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；Mini-REPOTEANⅡ（Bio-Red公司）；DYY-Ⅲ型电转移槽（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 MTT法检测莪术油对HEC-1-B细胞增殖抑制作用将生长达到80% ～90%的HEC-1-B细胞弃掉培养液，PBS冲洗后加入0.25%胰酶细胞消化液，当细胞密度达到1×104·mL-1时将此注入96孔板内，每孔200μL，放入体积分数5%CO2、37℃培养箱中培养24 h后，换液，各组加入含莪术油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的培养基150μL，对照组加入无血清的培养基，作用细胞48 h，于培养结束前4 h，每孔加入MTT试剂20μL（5 g·L-1），作用4 h，去除上清液，加入150μL，每孔DMSO，于摇床上低速振荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长测定吸光度（A）值。应用MTT法测细胞增殖抑制的情况。每组设8个平行复孔，计算细胞抑制率。

2.2 Hoechst33258荧光染色检测HEC-1-B细胞凋亡将对数生长期的HEC-1-B细胞制成浓度为1×105·mL-1单细胞悬液，接种于24孔板培养24 h后，进行分组，莪术油组加入含有不同浓度莪术油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的DMEM培养基，正常对照组加入无血清培养基，作用细胞48 h，进行Hoechst 33258荧光染色，镜下观察莪术油对细胞凋亡的情况并拍照。

2.3 W estern blot法检测相关蛋白表达对照组细胞加入无血清培养基，实验组加入莪术油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg· L-1、960 mg·L-1）处理细胞作用48 h后，收集细胞，放入冷的细胞裂解液中作用30 min，细胞样品反复吹打，4℃，12 000 g，离心半径8 cm，离心20 min后，把上清液移至新管，用BCA试剂盒测定蛋白含量，将各组蛋白含量调成一致。将玻璃板清洗干净后，蒸馏水冲洗，固定好板子后，配制10%SDS-PAGE凝胶溶液（根据分子量选择相应浓度的分离胶），每孔上样20μL，加适量电泳缓冲液，进行电泳来分离蛋白质，并适时终止电泳。将胶浸泡于转膜液中，标记胶的方向，然后于摇床上30 min低速震荡。截取和胶的大小一致PVDF膜，甲醇溶液浸泡，浸透后将PVDF膜转移浸入转膜液中5 min以上。取一张用转膜液浸润的滤纸放在半干转印仪的电极板底层上，放上PVDF膜，再将胶贴于PVDF膜上；再取用转膜液润湿另一张厚滤纸，铺在分离胶的上面，用玻璃试管压紧赶走气泡；盖上顶层电极板，接通电源，进行半干转印；转膜结束后，将PVDF膜浸泡在封闭液中，与胶相邻面要向上，放置在水平摇床上缓慢震荡1 h以上。取出PVDF膜，裁取想要的位置并放置于含有一抗抗体的杂交液盒中孵育；取出PVDF膜，应用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min；然后把PVDF膜放入装有二抗的杂交液盒中，摇床上震荡杂交1 h；取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次5 min；将ECL超敏化学发光试剂盒内的试剂A与试剂B等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应后利用凝胶成像采集系统进行曝光，并对蛋白条带进行分析。

2.4 统计学方法采用SPSS 17.0软件对实验结果进行分析，实验计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间样本的比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞增殖的影响与对照组比较，不同浓度的莪术油（120mg·L-1、240mg·L-1、480mg·L-1、960mg·L-1）作用HEC-1-B细胞48 h后，吸光度值明显降低，差异有统计学意义（t＝8.336，P＜0.01；t＝12.609，

P＜0.01；t＝13.583，P＜0.01；t＝17.766，P＜0.01），说明莪术油能够明显抑制HEC-1-B细胞的增殖，呈一定的浓度依赖性。根据各组吸光度值计算细胞抑制率，结果显示，随着莪术油浓度的增大，其对HEC-1-B细胞的抑制率也逐渐增加。见表1。

表1 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞增殖的影响（±s）

表1 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01

/%对照组组别 n 吸光度值 细胞抑制率8 1.14±0.12 0莪术油120 mg·L-1组 8 0.71±0.08** 37.10±7.10莪术油240 mg·L-1组 8 0.52±0.07** 53.90±6.20莪术油480 mg·L-1组 8 0.40±0.10** 65.20±8.70莪术油960 mg·L-1组 8 0.25±0.08**77.90±6.80

3.2 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞凋亡的影响荧光显微镜观察发现，与对照组比较，莪术油各组细胞都出现细胞核固缩、碎裂、荧光亮度变强等凋亡特征，细胞凋亡率显著增加。

3.3 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较，莪术油作用细胞48 h后，随着莪术油浓度的升高，细胞内Caspase-3蛋白表达均明显增加，差异有统计学意义（t＝6.079，P＜0.01；t＝19.545，P＜0.01；t＝34.903，P＜0.01；t＝21.151，P＜0.01）；Bax蛋白表达均明显增加，差异有统计学意义（t＝7.146，P＜0.01；t＝13.809，P＜0.01；t＝15.890，P＜0.01；t＝52.971，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（t＝0.797，P＞0.05；t＝3.044，P＜0.05；t＝6.309，P＜0.01；t＝11.455，P＜0.01）。见表2、图1。

表2 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

表2 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

Caspase3/GAPDH Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH对照组组别 n 3 0.359±0.015 0.599±0.072 0.252±0.019莪术油120mg·L-1组 3 0.440±0.017**0.548±0.084 0.593±0.055**莪术油240mg·L-1组 3 0.629±0.018**0.442±0.052* 0.735±0.044**莪术油480mg·L-1组 3 1.016±0.029**0.324±0.023** 1.031±0.071**莪术油960mg·L-1组 3 1.254±0.072**0.121±0.006** 1.142±0.017**

图1 不同浓度的莪术油对HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白表达的影响

4 讨论

自殷墟出土的甲骨文中，就有“瘤”的记载。汉代刘熙《释名》定义为“瘤，流也，血流聚生而瘤肿也。”周代有疡医之位，其主治范围包括“肿疡”，即肿瘤类疾病。子宫内膜癌相当于中医学的“癥瘕”，唐代孙思邈《千金要方》中载有明确的病机，明确其病位在下焦，为腹中积块，或胀或痛的疾病，并有固定的方药。《黄帝内经》认为“正气存内，邪不可干。”子宫内膜癌的基本病机是正气亏虚，热毒内聚，气滞血瘀。治疗原则是解毒化瘀，扶正消积。莪术具有破血逐瘀作用，可缩小瘤体，改善全身状况，提高生存质量［5-9］，莪术油可抑制HEC-1-B细胞增殖，并促进其细胞凋亡［10］。

细胞凋亡是删除细胞的一种选择性过程，是组织大小调节和形态发生所必需的生理过程。在哺乳动物细胞中，凋亡是由两种不同的信号途径诱导的：外部或死亡受体和内在或线粒体［6］。Bcl-2家族的蛋白质已被确定为线粒体途径的基本成分。Bcl-2家族的成员可以通过合成抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）或促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bd、Bcl-xs）来促进或抑制细胞凋亡。在人类的各种癌症组织中，包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌和子宫内膜癌，都观察到了抗凋亡Bcl-2基因的表达［7］。Bcl-2家族基因与子宫内膜癌之间的关系主要通过对人体组织样本的体外研究得到揭示［8］；过多的Bcl-2表达会减缓细胞生长，高表达会导致细胞死亡，而较低的表达则可能是抑制人类乳腺和子宫内膜癌组织凋亡的迹象。研究还表明，Bcl-2的表达因肿瘤的侵入性和分化程度而有所不同，而Bcl-2表达在较高级的癌症中与较低级的癌症相比是非常低或不存在的。据推测，在癌症发生发展期间，Bcl-2的表达可能会被抑制。因此，Bcl-2的表达高低被用来作为预测癌症进展和预后的重要指标。本实验结果表明，与对照组相比较，莪术油组Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达水平显著增加，且Bcl-2/Bax明显降低。说明莪术油可能是通过降低Bcl-2蛋白表达、增加Bax蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。

在细胞凋亡过程中，Caspase-3是最主要的终末剪切酶［9-10］，也是CTL细胞杀伤重要的组成部分。Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，可以被多种因素活化，被激活后，可以使蛋白酶多聚（ADP-核糖）及与细胞结构、细胞周期及DNA核酸复制等相关聚合酶PARP失活，从而导致细胞凋亡［11-12］。并且Caspase-3被激活后还可以进一步使Bcl-2灭活，让细胞的形态和功能发生改变，诱导细胞凋亡。已有研究表明，莪术油能导致肺腺癌A549细胞凋亡，其可能与Bcl-2和Bax蛋白表达有关。与对照组比较，莪术油作用HEC-1-B细胞48 h后，细胞内的Caspase-3和Bax蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著降低，Bcl-2/Bax的比值降低。表明莪术油能够诱导HEC-1-B细胞凋亡，其作用机制可能是通过增加了Caspase-3、Bax的表达水平和降低Bcl-2表达水平有关。

大量研究证实，莪术油具有抗肿瘤、抗病毒和提高人体免疫等作用，通过许多药理作用及临床应用研究，证明了莪术油药理活性较好、抗肿瘤效果好、药物安全性高。但莪术油成分较多且组成复杂，因此其抗肿瘤机制也比较复杂，我们的实验仅对莪术油凋亡因子方面做相关研究，为进一步研究莪术油抑制子宫内膜癌提供实验依据，但其作用机制需进一步研究。