曾平生，厉月桥，周新华，姚甲宝，潘文婷，熊光康

(中国林业科学研究院亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600)

华重楼（Paris polyphylla var.chinensis(Franch.)）又名七叶一枝花，为百合科重楼属植物，主要分布在我国长江以南江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州和云南等省份[1]。华重楼为2015 年版《中国药典》收载的重楼药材的基原植物，以干燥根茎入药，主要可用于消肿止痛、清热解毒、定惊凉肝等药用功能，可治疗毒蛇咬伤、跌打伤痛、咽喉肿痛、惊风抽搐等病症[2]。现代医学药理研究表明，华重楼化学成分包括甾体皂苷、蜕皮激素及其糖苷、黄酮等，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ等是其重要的生物活性成分和衡量药材质量的重要指标[3]，具有抗肿瘤[4-6]、止血镇痛、抗炎抑菌、调节免疫力[7]、促进骨细胞增殖分化等多方面功能[8]，为我国传统常用中药云南白药、宫血宁胶囊等 80 余种中成药的重要原料[9]。近年来，随着对华重楼野生种质资源的无序开采，许多地区种质资源已濒临灭绝、种质遗传多样性锐减。开展华重楼天然种质收集、保存和评价工作，筛选生物活性成分高的优良种质，对华重楼种质资源保护和合理利用具有十分重要的意义[10]。

目前，国内外对于华重楼的研究集中在化学成分分析与药理活性研究[11-13]、有效成分提取[14]、治疗机制[15-16]和人工育苗、栽培方面[17-18]。而许多药用植物的生物活性成分与原产地气候生态因子密切相关，并在长期进化过程中形成特有的地理种源变异模式。因此研究重楼种质变异规律，优良种质筛选和人工栽培均具有重要意义。陈铁柱等通过研究，证实了我国华重楼西部产区四川、重庆、云南等省7 种重楼皂苷甾体含量具有明显差异，与气候生态因子间亦存在密切关系[19]。但现有研究还未能从全分布区尺度反映华重楼主要生物活性成分的种源差异，并系统揭示华重楼根茎总皂苷、总酚酸、黄酮性状指标的地理种源变异模式及其与原产地地理、气候因子的相关关系，同时关于华重楼主要生物活性成分间的相关性分析方面的研究也相对较少。而对药用植物开展种源评价、优良种质鉴定是种植基地选址和遗传改良十分基础的工作。

本研究在对我国华重楼天然分布区10 个种源种质收集的基础上，开展了不同种源根茎器官总酚酸、黄酮、重楼总皂苷和皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的地理变异规律研究及主要生物活性成分间的相关性分析，旨在为华重楼遗传改良和丰产栽培提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料的收集与处理

华重楼种源种质收集点选择与地理气候因子信息的收集。首先查阅我国华重楼天然分布范围和分布地点相关资料基础上，设置了河南、湖北、安徽、江西、广东、广西、重庆和湖南8 省份10 个地理种源收集地点，所采种源样本基本覆盖了华重楼在中国主要地理分布区。各种源所在的地理、生态气候因子见表1。计算种源地与温度相关的气象因子时，以当地气象台站数据为依据，按海拔每上升100 m，温度降低0.55℃进行修正[20]。

表1 华重楼种源采样地理位置及主要气象因子Table 1 Geographical locations and meteorological factors of the sampled provenances of Paris polyphyllavar. chinensis

华重楼种源种质的收集。于2018 年9 月—12 月，在每一种源选择4—5 a 生，生长健康、发育完好的华重楼植株30 株以上，植株间距离40 m以上，采集根茎部作为种源样品。样品采回后，经中国林业科学研究院亚热带林业实验中心植物分类专家王燕良高级工程师鉴定，均为华重楼植株。

1.2 样品检测与分析

1.2.1 总黄酮、总酚酸含量测定 先将华重楼根茎样品分单株用清水洗净，放入110℃烘箱杀青30 min，然后在45℃条件下烘干至恒质量。将烘干的样品粉碎过100 目筛，作为待测样品。

总黄酮的测定采用三氯化铝法进行测定[21]。称取粉碎样品0.2 g，3 mL 95%乙醇，50℃水浴超声处理30 min，收集至10 mL 容量瓶，重提3 次，合并上清液，冷却至刻度，备用。取7 mL 上清液于25 mL 的比色管中，加入1.5% AlCl38 mL 和醋酸-醋酸钠的缓冲液（PH 5.5）4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h，于415 nm下测试吸光度值。配置一系列浓度的标准溶液，按照上述样品溶液的显色方法同步显色，于415 nm下测试吸光度值，以吸光度为纵坐标，显色液中芦丁的质量（mg）为横坐标，作标准曲线，将得到的标准曲线方程计算样品中总黄酮含量。

总酚酸含量采用高效液相色谱法测定[22]。对照品溶液的制备，取迷迭香酸对照品和丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL 含迷迭香酸7 μg、丹酚酸B60 μg 的混合溶液，即得。供试品溶液的制备 取供试品5 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加水使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定。色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25 cm，内径为4.6 μm，粒径为5 μm）；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B；检测波长为286 nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0 mL。

1.2.2 重楼皂苷含量测定 重楼皂苷含量采用高效液相色谱法测定[23]。对照品溶液的制备，取重楼皂苷I 对照品、重楼皂苷II 对照品、重楼皂苷VI 对照品及重楼皂苷VII 对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 各含0.4 mg 的混合溶液，即得。供试品溶液的制备，取样品粉末（过三号筛），称取0.5 g 左右样品，精密加入乙醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，待冷却后再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，进样。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，检测波长为203 nm，进样量10 μL。以下为华重楼样品皂苷的HPLC 色谱图（图1）。

1.3 数据分析

利用WPS EXCEL 软件进行原始数据的整理、统计；利用SPSS 20. 0 软件进行方差分析、多重比较、相关和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 华重楼根茎主要生物活性成分含量的种源差异

不同种源华重楼根茎主要生物活性成分含量比较（表2）。由表2 可以看出，不同种源华重楼根茎生物活性成分含量具有很大差异，总酚酸含量的变异范围为1.718～5.436 mg·g−1，广西桂林种源总酚酸含量最高，达5.436 mg·g−1，是总酚酸含量最低江西新余种源的3.16 倍。总黄酮含量的变异范围为0.780～1.457 mg·g−1，含量最高的广西桂林种源与含量最低的安徽祁门种源间相差了1.87 倍。不同种源总重楼皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）含量变异幅度为0.107～7.399 mg·g−1，其中江西丰城种源含量最高，河南新县种源含量最低，前者是后者的69.149 倍。

图1 华重楼4 种皂苷标准品的HPLC 色谱Fig.1 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin in Paris polyphylla var.chinensis. sample

在华重楼根茎重楼皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量中，皂苷Ⅰ的变异范围为0.008～2.106 mg·g−1，皂苷Ⅱ的变异范围为0.000～0.646 mg·g−1，皂苷Ⅵ的变异范围为0.000～0.521 mg·g−1，皂苷Ⅶ的变异范围为0.00～9.170 mg·g−1。其中河南新县种源未能检出皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ号含量，广西桂林种源未能检出皂苷Ⅱ、Ⅵ含量。方差分析表明，不同种源华重楼根茎总酚酸、总黄酮、总皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）、皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和皂苷Ⅶ的含量均存在极显著差异（P< 0.01）。

2.2 华重楼根茎主要活性成分含量与气候生态因子相关性分析

对华重楼根茎主要活性成分含量与气候生态因子间的相关性的显著性检验表明，华重楼根茎总酚酸含量与海拔、总黄酮含量与全年日照时数、皂苷Ⅱ含量与1 月均温间相关性显著（P< 0.05），相关系数值分别为0.662、−0.708 和0.752。说明总酚酸含量与海拔、皂苷Ⅱ含量与1 月均温间存在中度正相关关系，总黄酮含量与全年日照时数间存在中度负相关关系。总皂苷含量与海拔、皂苷Ⅱ与年均温、皂苷Ⅵ含量与7 月均温、皂苷Ⅶ含量与海拔的相关性极显著（P< 0.01），其相关系数分别达到−0.840、0.877、0.821 和−0.766，表明总皂苷与海拔间呈高度负相关，皂苷Ⅱ与年均温、皂苷Ⅵ与7 月均温间存在高度正相关关系，皂苷Ⅶ含量与海拔存在中度正相关关系。总酚酸含量与东经和全年日照时数、总黄酮与东经、皂苷Ⅰ与东经相关系数较小且达未到显著水平（P> 0.05）但存在较弱的负相关性，而总皂苷含量与年均温和7 月均温，皂苷Ⅶ含量与年均降雨量间存在一定的正相关性（表3）。

表2 不同种源华重楼主要生物活性成分含量差异Table 2 The difference of main medicinal active constituents contents of Paris polyphyllavar.chinensis from different provenances

2.3 华重楼根茎主要药物活性成分含量相关分析

由表4 可以看出，华重楼根茎中总酚酸与总黄酮含量、皂苷Ⅰ与皂苷Ⅱ含量间相关性显著，其相关系数分别为0.753、0.777 和0.637。说明华重楼根茎中总酚酸与总黄酮含量、总黄酮与皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ与皂苷Ⅱ含量呈中度正相关。总黄酮与皂苷Ⅰ含量和总皂苷与皂苷Ⅶ间的相关性达极显著水平，总皂苷与皂苷Ⅶ的相关系数为0.941，说明总皂苷与皂苷Ⅶ含量呈高度正相关。其它指标间的相关性均未达到显著性水平，但总酚酸含量与总皂苷、总酚酸与皂苷Ⅶ含量、总黄酮与皂苷Ⅶ含量相关系数均存在负相关性，皂苷Ⅰ与皂苷Ⅵ呈正相关性。

2.4 不同种源华重楼药用成分含量聚类分析

以华重楼根茎总酚酸、黄酮和皂苷含量为特征指标，对10 个华重楼种源聚类分析结果（图2）。从图2 可以看出，以欧式距离15 为分界阈值，可将华重楼种源聚类为3 个类群，分别为低酚酸、低黄酮、高皂苷含量类群，高酚酸、高黄酮、低皂苷类群和中酚酸、中黄酮、中皂苷类群。其中安徽祁门种源属低总酚酸、低黄酮和高皂苷含量类群，河南新县、湖北宜昌和重庆石柱属高酚酸、高黄酮、低皂苷类群，其余种源属中酚酸、中黄酮、中皂苷类群。

表3 华重楼主要生物活性成分与产地气候生态因子相关性分析Table 3 Correlation analysis of main medicinal active constituen and ecological factors of Paris polyphyllavar. chinensis

表4 华重楼根茎中主要生物活性成分的相关性分析Table 4 Analysis of correlation between main medicinal active constituent of Paris polyphyllavar.chinensis

图2 不同种源华重楼总皂苷、黄酮和总皂苷含量聚类分析Fig.2 Cluster Analysis of phloridzin and trilobatin and total saponin contents in Paris polyphylla var.chinensis of different provenances

3 讨论

重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等4 种活性成分含量是中药材重楼质量的主要评价标准。本研究表明不同种源间华重楼根茎中总酚酸、总黄酮和重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 个重楼皂苷及其总含量差异极显著。从种源所处的地理位置来看，华重楼分布区北部种源重楼皂苷含量总体低于中南部种源含量。因此，今后在华重楼的中南部种源开展优良种质选择或开展人工仿生栽培，将取得较好的效果。

本研究通过对华重楼根茎中总酚酸、总黄酮和重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 个重楼皂苷及其总含量与其原产地气候地理因子的相关分析表明，原产地海拔分布高的华重楼种源，具有较高的总酚酸含量，但其总皂苷含量和皂苷Ⅶ较低，年均温和1 月均温较高的种源根茎中皂苷Ⅱ含量相应较高，7 月均温高的种源皂苷Ⅵ含量相应较高，而全年日照数高的种源总黄酮含量较低。因此，在海拔低、年均温、1 月均温和7 月均温高的地区开展华重楼优良种质筛选工作，更易于获得重楼总皂苷、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量高的优良种质，而在海拔高和全年日照时数少的地区更容易筛选到高总酚酸和总黄酮含量的优良种质。

华重楼根茎中总酚酸与总黄酮含量、总黄酮与皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ与皂苷Ⅱ含量呈中度正相关关系，总皂苷与皂苷Ⅶ含量呈高度正相关关系。这说明通过对这些具有相关性次生代谢物二者中一个指标的检测，可以初步评估另外一个指标含量的高低。这种方法在野外样品选优评价的初选阶段，可以有效降低样品检测的工作量，提高评价效率。本研究中总酚酸与总黄酮，总黄酮与皂苷Ⅰ类别之间的显著正相关性，可能与这些次生代谢物对原产地复杂生态环境因子响应具有高度相似性有关，此方面还有待于进行更深入的研究。

本研究证实了不同种源华重楼根茎主要生物活性成分含量存在极显著差异，然而对华重楼生物活性成分形成地理种源差异的机制尚不明确，有待于在其全分布区进行多点种源试验，解析其主要生物活性成分的形成机制。

4 结论

不同种源间华重楼根茎中总酚酸、总黄酮和重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ4 个重楼皂苷及其总含量差异极显著。广西桂林为总酚酸和总黄酮含量最高的种源，安徽祁门为总重楼皂苷含量最高的种源。华重楼根茎中总酚酸含量与原产地海拔、皂苷Ⅱ与1 月均温呈中度正相关关系，总黄酮含量与全年日照时数、皂苷Ⅶ与海拔呈中度负相关关系。总皂苷与海拔间呈高度负相关关系，皂苷Ⅱ与年均温、皂苷Ⅵ与7 月均温间均呈高度正相关关系；华重楼根茎中总酚酸与总黄酮含量、总黄酮与皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ与皂苷Ⅱ含量呈中度正相关关系，总皂苷与皂苷Ⅶ含量呈高度正相关关系。通过聚类分可将华重楼种源划分为三个类群，安徽祁门属低酚酸、低黄酮、高皂苷类群；河南新县、湖北宜昌和重庆石柱属高酚酸、高黄酮、低皂苷类群；湖南张家界、江西丰城、江西分宜、广西桂林、江西信丰和广东连州属中酚酸、中黄酮和中皂苷类群。