孙喆喆 王刚，2# 黄鑫 赵晓波 王磊 韩浩伦 李保卫 刘红丹 李连勇 吴玮，2

咽喉反流性疾病(laryngophyngeal reflux disease,LPRD)是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位，引起一系列症状和体征的总称[1]。LPRD发病率高，与多种耳鼻咽喉科疾病相关[2]，是近年来的研究热点。国外研究显示LPRD的发病与抗反流屏障、食管廓清能力及靶器官的敏感度等多种因素有关[3]，但目前该病的发病机制尚未完全明确，建立安全有效的动物模型对该病的发病机制及治疗方法的研究显得尤为必要。目前内源性动物LPRD模型的造模机制主要是通过破坏抗反流屏障，尤其是下食管括约肌(lower esophageal sphincter, LES)的结构和功能，导致胃内容物反流至上气道，从而引发LPRD[4～6]。本研究通过下食管括约肌球囊扩张法建立新西兰兔的LPRD模型，并通过检测扩张前后LES压力、咽喉及食管pH值变化、喉镜下反流体征及组织病理学改变对模型进行验证，旨在为进一步研究LPRD提供一种安全、有效、微创的动物模型，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 选择5月龄雌性新西兰白兔18只(购自科宇动物养殖中心，北京)，体重2.5～3.0千克，通过体重排序后，按随机数字表随机分为实验组10只和对照组8只，所有动物饲养于自动控制明暗环境中，恒温恒湿，每日喂食两次，自由饮水，适应性饲养3天后开始实验。实验组行下食管括约肌扩张术，对照组进行假扩张，单纯置入球囊，不进行注水扩张。所有实验动物的处理协议遵守严格的批准程序且与国家实验动物使用指南一致，本研究获得战略支援部队特色医学动物伦理委员会批准。

1.2下食管括约肌扩张术建立LPRD兔模型 动物术前禁食24小时，禁水6小时，10%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔麻醉后固定于操作台，经口置入Hercules扩张球囊(美国Wilson-Cook Medical公司，最大扩张直径1.5 cm，有效扩张长度5.5 cm)。通过食管测压确定LES距门齿的距离，气囊沿导丝插入食管内，使气囊中心位于测定位置，缓慢向球囊内注水，注水过程不少于30秒，最终压力维持在1 atm，维持5 min，重复扩张2次，间隔3 min，此两次扩张记为一轮扩张。扩张过程中对动物进行心电、血氧饱和度监测，若出现心率、血氧异常下降立即中止操作，术后禁食24小时，进水不限。依据下文pH监测结果判断扩张建模是否有效，对于第一轮扩张无效的实验组动物进行第二轮扩张。

1.3下食管括约肌测压及定位 扩张前1周及扩张后2周行下食管括约肌测压。选用荷兰MMS公司的定制单导联固态食管测压导管，动物术前禁食24小时，禁水6小时，麻醉后固定，校正仪器。经口置入测压导管，先将电极位置向下放至胃内，此时压力约10 mmHg，且曲线平直，无呼吸波。缓慢上提电极，直至出现规律性压力升高，在此时处于门齿处的导线上做标记，记为LES下缘，继续缓慢上提可见压力继续升高，每个位置保持3个收缩周期，直至压力降低到低于胃内压且存在规律呼吸波，记为LES上缘。通过仪器自带软件可以算出LES平均静息压，并可根据导线标记位置，准确定位LES距离门齿的距离。扩张后2周再次行LES测压，比较扩张前后LES压力的变化。

1.4咽喉及食管下段pH值监测 于球囊扩张前1周和扩张后2周进行咽喉及食管下段pH值监测，观察咽喉反流及胃食管反流情况。动物麻醉后固定，经口置入2根Restech DX-pH检测电极(美国Respiratory Technology公司)，进行咽部及食管下段pH值同步监测，监测电极使用前均在pH 4.0和pH 7.0校准液内校准。咽部电极放置在下咽部，食管电极放置在此前测压定位的LES上缘上3 cm处，监测时间为2小时，通过DX-pH检测仪的自带软件进行数据分析，记录pH<5的酸反流事件百分比、反流事件数、反流最长时间，参考人类LPRD诊断标准[7, 8]，2小时内观察到咽喉pH<5的反流事件≥1次，视为造模成功，经两轮扩张仍未达到标准视为造模失败。

1.5喉镜检查和反流体征评分 扩张前1周、扩张后2周及扩张后8周行喉镜检查并拍照，目前并无兔的反流体征评分系统，所以参考Belafsky等[9]提出的人类反流体征评分(reflux founding score，RFS)对其喉部图像的各项体征(声门下水肿、喉室消失、红斑/充血、声带水肿、弥漫性喉水肿、后联合增生、肉芽肿、喉内黏稠黏液附着)进行评分。

1.6病理检查 扩张后8周所有实验动物麻醉后，行股动脉切开放血法处死，取喉部黏膜及食管下段组织，置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规HE染色后，光镜观察组织学改变。

2 结果

2.1LPRD兔模型造模结果 实验组10只动物中LPRD造模成功8只，失败1只，死亡1只，经解剖发现死因为肺部感染；造模成功的8只动物中6只为一轮扩张后建模成功，2只为二轮扩张后建模成功。对照组8只，存活7只，死亡1只，死因为腹泻。

2.2下食管括约肌测压结果 实验组建模成功的8只动物，LES中点距离门齿24.2±0.8 cm，LES长度0.8±0.3 cm，扩张前LES压力28.0±5.6 mmHg，扩张后LES压力17.2±3.3 mmHg。对照组存活的7只动物，LES中点距离门齿24.1±0.7 cm，LES长度0.9±0.2 cm，扩张前压力27.6±4.7 mmHg，扩张后压力23.3±2.4 mmHg。实验组扩张后LES压力较扩张前显著降低(t=6.19，P=0.001)，且扩张前LES收缩波规整，扩张后收缩波紊乱不规整(图1)，对照组假扩张前后LES压力无显著统计学差异(t=1.36，P=0.246)。

2.3喉镜RFS评分结果 实验组扩张前1周RFS评分3.1±1.2分，扩张后2周为3.6±1.4分，扩张后8周为8.6±2.5分，对照组扩张前1周为2.4±1.5分，扩张后2周为2.6±1.3分，扩张后8周为2.8±0.8分，实验组扩张前与扩张后两周的RFS评分无统计学差异(P=0.482)，但扩张前与扩张后8周有统计学差异(P=0.005)。实验组扩张后主要表现的LPRD体征为声门下水肿、喉部黏液附着、弥漫性喉部水肿等，其中1例动物出现声突肉芽肿。对照组扩张前后的喉镜图像基本正常，扩张后2周及8周较扩张前评分差异无统计学意义(P=0.815，P=0.717)(图2)。

2.4咽喉pH值监测结果 建模成功的8只实验组动物扩张前后咽喉2 h pH检测结果(图3)示：扩张前1周实验动物pH<5的酸反流时间百分比(%)、反流事件数(次)、反流最长时间(s)分别为：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，扩张后2周分别为：17.5(8.2,29.4)、3(1,5.5)、17.2(10.2,30.8)，扩张后较扩张前增加，差异有统计学意义(均为P<0.001)。对照组动物扩张前1周pH<5的酸反流时间百分比(%)、反流事件数(次)、反流最长时间(s)分别为：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，假扩张后2周分别为：0(0,3.1)、0(0,0.5)、0(0,3.7)，假扩张前后各项监测数据差异无统计学意义(均为P>0.05)，扩张后2周实验组各项反流指标较对照组均有提高，差异有统计学意义(均为P<0.01)。

2.5食管下段pH值监测结果 扩张前后食管下段2 h pH检测结果示：实验组动物扩张前1周监测酸反流时间百分比(%)、反流事件数(次)、反流最长时间(s)分别为: 0(0,0.7)、0(0,1)、0(0,1.2)，扩张后2周分别为：23.1(4.8,49.5)、3(1,6)、25.9(11.5,56.8)，较扩张前增加，差异有统计学意义(均为P<0.05)。对照组动物扩张前1周pH<5的酸反流时间百分比(%)、反流事件数(次)、反流最长时间(s)分别为：0(0,0.6)、0(0,1)、0(0,1)，假扩张后2周分别为：0(0,2.7)、0(0,1)、0(0,2.1)，假扩张前后各项监测数据差异无统计学意义(均为P>0.05)。扩张后实验组较对照组食管各项反流指标均有提高，差异有统计学意义(均为P<0.01)。

2.6病理检查结果 对照组喉部及食管黏膜无明显炎症表现，实验组喉部及食管黏膜均可观察到不同程度的炎症，喉部黏膜主要表现为淋巴细胞、浆细胞浸润性慢性炎症，伴间质水肿、腺体增生；食管黏膜表现为淋巴细胞浸润性慢性炎症，局部可以观察到鳞状上皮角化不全(图4)。

3 讨论

LPRD是近年来研究的热点，选择和建立有效的动物模型对该病的机制研究十分重要。LPRD的动物研究有活体研究和离体研究，活体研究动物模型多借鉴于胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)的动物模型，建立方法主要是通过内源性和外源性两种方法[3, 10]。外源性方法主要是通过向实验动物咽喉部喷洒或者灌注胃酸、胃蛋白酶、胆盐中的一种或多种物质从而构建模型，此方法简单易行且动物存活率较高，但并不符合反流的病理生理，且灌注液与真实反流物并不完全相同，无法完全揭示LPRD的发生发展。内源性方法主要通过手术改变胃肠道解剖或者破坏反流屏障，造成胃肠内容物反流，目前常用的建模方法包括LES切开或切除术[4]、LES扩张加上食管括约肌(upper esophageal sphincter, UES)支架植入[5]、幽门或十二指肠缩窄术[6]等。内源性方法构建的动物模型更加符合反流的病理生理，但是手术难度较大，对动物创伤较大，动物存活率较低。另外，国内有学者探索通过病因学进行建模，进行了睡眠剥夺和高脂饮食诱发LPRD的动物模型研究[11]，不失为一种另辟蹊径的好方法，不过这种方法建模后必然混杂了睡眠剥夺和高脂饮食两种因素，对结局指标与LPRD因果关系判断有一定影响。

LPRD内源性动物模型与GERD模型的互相借鉴源于两病在病因学上有所重叠，均涉及反流屏障的完整性、反流的频率和持续时间、反流物的酸度、食管廓清率、胃排空率、黏膜屏障的完整性、靶器官的敏感性等因素，其中LES是反流屏障的重要组成部分，既往研究显示LES一过性松弛不但是GERD的重要病因，同样也是LPRD的重要发病机制[3, 12]，LES松弛后，气态或气液态混合反流物到达食管时，可引起食管壁的迅速扩张，继而引起UES的松弛反射，从而利于反流物反流至咽喉，引起LPRD[13, 14]。本课题组的研究[15]也证实LPRD患者中胃食管阀瓣区的松弛程度与RFS评分存在相关性，提示LES的松弛度与LPRD病情严重程度相关。既往的动物研究显示兔模型中即使不对UES进行处理，单纯切除LES造成的慢性的胃食管反流也可以引起咽喉反流[16]。但内源性方法构建LPRD模型存在手术难度大，动物创伤大，动物存活率低等缺点，近年来有研究显示食管括约肌球囊扩张法可以安全有效地构建GERD动物模型[17]，此方法通过球囊扩张，使部分LES括约肌纤维拉长甚至断裂，造成LES松弛，而生理情况下胃内压高于食管内压，从而导致胃食管反流的发生，继而可能引发LPRD。此方法的难点为LES的准确定位和适度扩张，既往研究多是通过开腹直视橡皮筋固定球囊位置避免球囊松脱移位[18]，增加了造模难度和动物死亡率。

本研究借鉴了LES球囊扩张法，并予以改进完善。鉴于此法中LES定位及球囊固定的难点，本研究使用食管测压准确定位每只实验动物的LES位置，避免了因球囊位置不当导致的食管破裂及LES扩张不足。此外本研究选用专用的消化道扩张球囊，其有效扩张长度达5.5 cm，有效扩张长度内球囊呈柱状，不易发生移位，预实验中切开食管观察见球囊可对LES进行全长扩张且无明显移位。本球囊有效扩张直径可选1.0 cm、1.5 cm、2.0 cm，经预实验确定1.5 cm直径的球囊可以对5月龄实验用新西兰白兔的LES进行有效扩张，扩张时注意球囊加压一定要缓慢均匀，加压过程不小于30秒；扩张完成后食管下段呈半透明状，可使部分平滑肌断裂或破坏，造成食管下段松弛或失去张力，扩张后2周食管测压仍可观察到LES静息压较扩张前显著降低，且收缩波紊乱不规整，证实了经此法LES得到了有效扩张。另外，本研究发现虽然扩张前动物禁食水，但扩张球囊取出时，仍会带出少量胃内食物残渣，此时应注意使用负压吸引器将咽喉部及食管上段的食物残渣吸除干净，避免误吸导致动物死亡。因为兔的咽部细小，较易发生喉痉挛及误吸，本研究中虽对食物残渣进行了彻底吸引，仍有1只动物因肺部感染死亡。

本研究结果显示对实验用新西兰白兔单纯LES的有效扩张即可造成LPRD，且伴有GERD；通过LES测压可见，扩张后LES多出现较严重的松弛改变，且收缩变得不规律；pH值监测验证建模后实验动物咽喉及食管各项反流指标均较建模前显著提高，病理检查显示实验组喉部黏膜出现淋巴细胞浸润、间质水肿、腺体增生等慢性炎症表现；说明此方法通过对LES的准确定位和有效扩张可建立兔的LPRD模型，且操作相对简便，安全有效，对动物造成创伤较小，实验组仅死亡1只，且无食管破裂发生，符合实验动物伦理及3R原则。本研究建模成功率为80%(8/10)，符合LPRD病理生理过程，适合长期观察反流所致的气道黏膜损伤。由于反流物质引起的上呼吸道炎症是一个慢性过程，本研究中观察到造模2周后实验动物的喉镜评分较建模前无显著差异，而8周后喉镜下可见典型的LPRD的相关体征，如声门下水肿、喉部黏液附着、喉部弥漫性水肿，甚至有1只实验动物出现声突肉芽肿，提示LPRD动物实验的观察时间不宜过短。因此，LPRD建模过程尽量选用微创的造模方法，这样可以保证动物长时间存活，便于观察慢性反流所致的病理改变。

综上所述，本研究通过食管测压定位LES，使用球囊扩张的方法建立了LPRD的动物模型，经LES测压、pH监测、喉镜下表现及病理验证了模型的有效性，为LPRD的研究提供了一个微创、安全、有效的动物模型，并为该病机制研究开拓了新的思路。本模型与目前绝大多数研究LPRD的动物模型一样，借鉴于GERD动物模型，实验动物在出现咽喉反流的同时必然伴发较严重胃食管反流，而临床中的LPRD患者往往不伴有典型的GERD[19]，如何构建单纯LPRD模型是未来的研究难点和方向。