王旭 彭洁 朱延松 杨胜男 张晓楠 余洪 江东 梁大成

摘要 [目的]用17对SSR引物对68份柚类种质资源进行遗传背景研究，推演其亲缘关系，为更好地利用这68份材料提供参考。[方法]17对SSR引物进行PCR扩增;用 Power Marker V3.25軟件计算观测等位变异数（Na）、有效等位变异数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农多样性指数（I）和引物多态信息含量（PIC）;用 Ntsys2.0 计算材料间的遗传距离并进行聚类;用Structure2.3.4推导群体遗传结构。[结果]17对引物扩增出62条多态性条带，平均为3.647 0条。计算得出这62个多态性标记位点的平均等位变异数Na为3.470 6 ，平均有效等位变异数Ne为2.152 3 ，平均观测杂合度Ho为0.454 2 。平均期望杂合度He和香农多样性指数I分别为0.481 0和0.848 2，多态信息含量（PIC）平均值为0.419 8。在遗传距离0.36处将材料分成5个类群，结构分析中将材料分成4个组群，聚类分析和结构分析结果基本一致。[结论]所选材料具有丰富的遗传多样性，聚类和结构分析的结果能直观地了解这68份材料的亲缘关系，并对其中可能的同物异名品种进行筛选。

关键词 柚;SSR分子标记;亲缘关系

中图分类号 Q943  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）04-0100-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.027

Analysis of Genetic Relationship of 68 Pummelo Germplasm Resources Based on SSR Molecular Marker

WANG Xu1，PENG Jie2，ZHU Yan-song2 et al （1.School of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025;2.Citrus Research Institute of Southwest University，Chongqing 400712）

Abstract [Objective] 17 pairs of SSR primers were used to study the genetic background of 68 pummelo germplasm resources and deduced their genetic relationship，so as to provide reference for better use of these 68 materials. [Method]17 PCR amplification was performed on SSR primers; Power Marker V3.25 software was used to calculate the observed allelic variance （Na），effective allelic variance （Ne），observed heterozygosity （Ho），expected heterozygosity （He ），Shannon diversity index （I） and primer polymorphism information content （PIC）; use Ntsys2.0 to calculate the genetic distance between materials and clustering; use Structure 2.3.4 to derive population genetic structure. [Result]The 17 pairs of primers amplified 62 polymorphic bands，with an average of 3.647 0 bands. It is calculated that the average allelic variance Na of the 62 polymorphic marker loci is 3.470 6，the average effective allelic variance Ne value is 2.152 3，and the average observed heterozygosity Ho value is 0.454 2. The average expected heterozygosity He value and Shannon diversity index I value are 0.481 0 and 0.848 2，respectively. The average PIC value of polymorphic information content is 0.419 8. The material was divided into 5 groups at the genetic distance of 0.36，and the material was divided into 4 groups in the structure analysis. The results of cluster analysis and structure analysis were basically the same. [Conclusion]The selected materials have rich genetic diversity，and the results of clustering and structural analysis can intuitively understand the genetic relationship of these 68 materials，and filter possible synonymous varieties among them.

Key words Pummelo;SSR molecular marker;Genetic relationship

基金项目 国家重点研发计划子课题“果树优质高效品种筛选及配套栽培技术研究”（2019YFD1001400）。

作者简介 王旭（1993—），男，重庆人，硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。通信作者，江东，副研究员，硕士，硕士生导师，从事果树资源与遗传育种研究;梁大成，教授，博士，硕士生导师，从事湿地作物远缘嫁接技术研究。

收稿日期 2020-10-14;修回日期 2020-11-02

柚是柑橘属基本种之一，在柑橘中具有重要的生物学地位，同时在中国柑橘产业上也占有重要的经济地位[1]。中国是柚类的原产国和主要栽培国之一，根据《禹贡》的记载，柚在我国已有 4 000 多年的栽培历史[2]。柚多以实生繁殖，且多为单胚，在不同的地理环境下长期的自然变异和遗传育种产生了丰富的可遗传变异品种，形成了丰富多样的种质资源[3]。人类的社会活动过程会导致不同地域之间的品种交流，但在引种栽培过程中，由于天然的杂交或者人为因素可能会造成品种混乱，同一品种在不同区域可能会有不同的名称，这给种质资源的保存和利用带来不便。引种过程一般是通过枝条嫁接，但是单从叶片表型很难判断出具体的品种，加上柑橘类果树的童期较长，短时间内也很难得到果实，在此期间，如果品种错乱，将会造成人力和财力损失，因此从分子水平上对品种进行鉴定以及亲缘关系的推演显得极为重要。简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记技术，其特点是等位基因变异数多、多态性高，稳定性和重复性好，呈共显性遗传，是果树上鉴定种质资源、分析遗传多样性及亲缘关系应用中最为广泛的分子标记[4]。由于SSR分子标记不受植物生长时期以及环境因素的影响，所以以其为基础的聚类分析能更好地反映品种间的亲缘关系。Ahmed等[5]用60对SSR引物筛选出26对具有多态性位点的引物对来自印度的14份柚类种质

资源进行分析，发现虽然它们有很高的形态差异性，但是在分子标记上表现出较低的遗传多样性，因为这14份资源全是来自体细胞变异的品种。Kongsri等[6]用10对SSR引物估算了泰国南部、中部和北部的商业品种和杂交品种之间的遗传距离，共产生33个等位基因，預期杂合性和多态性信息含量的平均值分别为0.52和0.45，结果显示泰国本地柚比商业品种有更高的遗传多样性。来自土耳其的学者用SSR分子标记将柚和葡萄柚进行了区分[7] 。刘勇等[8]用31对引物从122份柚类材料中检测到335个等位基因变异，用UPGMA方法将122份材料分成7个亚群，18个小的组群，其结果分布主要呈沙田柚、文旦柚以及庞大的柚杂种群这三大类型。雷天刚等[9]从105对SSR引物中筛选出5对引物，组合成2组引物构建了沙田柚、琯溪蜜柚、晚白柚、强德勒柚、梁平柚的特征指纹图谱。刘冬峰等[10]用23对引物对浙江地方柚的遗传多样性进行研究，筛选出4对引物组合构建柚种质鉴定图，能对18份柚进行准确鉴定。国家果树种质重庆柑橘圃新引种一批柚类种质资源，尚未结果，从树形和叶形上难以对其亲缘关系准确判断。该试验用17对SSR引物对68份柚类种质资源进行遗传背景研究，推演其亲缘关系，以期为更好地利用这68份材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 供试的68份材料，包括64份柚、4份葡萄柚，均采自国家果树种质重庆柑橘圃，供试材料名称见表1。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取。

采集68份材料的成熟叶片，利用改良CTAB法提取样品DNA[11]，用NanoDrop 2000分光光度计测量其DNA浓度并统一稀释至50 ng/μL备用，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.2 SSR引物合成。参试引物来自李益等[12]报道的17对柑橘品种鉴定的SSR引物，引物由北京六合华大基因有限公司合成，引物信息见表2。

1.2.3 PCR反应。

PCR反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix（擎科生物公司）10 μL，正、反向引物（1 μmol/L）各0.5 μL，DNA样品100 ng，用ddH2O补足。PCR反应程序为94 ℃ 预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺电泳。

根据王炯[13]方法进行聚丙烯酰胺电泳，略有改动。检测合格的DNA用对应引物进行PCR扩增，随后用10%聚丙烯酰胺胶进行电泳，120 V电泳3 h，用0.1%硝酸银进行染色，1.1%氢氧化钠显色，然后拍照记录。

1.2.5 数据统计及分析。

条带统计按01格式记录，在相同迁移率位置的记成1，无条带的记成0，形成01矩阵。根据不同软件使用格式对数据转换。

用 Power Marker V3.25软件分析观测等位变异数（Na）、有效等位变异数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农多样性指数（I）和引物多态信息含量（PIC）。

用 Ntsys2.0 计算材料间的遗传距离并进行聚类。

用Structure2.3.4推导群体遗传结构[14]，使用混合模式并设定群体内等位基因频率相关模型进行群体遗传结构分析，通过马尔可夫链蒙特卡洛方法对个体基因型进行反复抽样，从而判断个体来源。具体操作如下：首先设定亚群数目K=[1，8]，每个K运行10次，将MCMC的不作数迭代次数设为20 000次，再将迭代后的MCMC设为20 000次，利用在线Structure Harvester（http：∥taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）计算最佳K值，即ΔK最高时的K值。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

SSR标记片段的分子量主要集中于200～500 bp，选取引物P13电泳图进行展示（图1）。试验所用17对引物共扩增出62条多态性条带，平均多态性条带数为3.647 0。其中引物P22扩增出多态性条带数最多，为6条;引物P4、P100、P190、P294扩增出多态性条带数最少，为2条。用Power Marker V3.25软件统计发现，这62个多态性标记位点的等位变异数Na为2～5，总平均值为3.470 6;有效等位变异数Ne为1.076 2～3.504 4，总平均值为2.152 3;观测杂合度Ho为0.044 1～1，总平均值为0.454 2;期望杂合度He为0.071 4～0.764 8，总平均值为0.481 0;香农多样性指数I为0.157 5～1.517 3，总平均值为0.848 2;多态信息含量（PIC）为0.068 3 ～ 0.723 0，平均PIC值为0.419 8，各引物数据见表3。

2.2 聚类分析

基于遗传距离对68份柚类种质资源聚类（图2）。在遗传距离0.36处，68份材料被分成5个类群。类群 Ⅰ 由无核沙田柚（1）、麻布文旦（6）、黄肉蜜柚（26）、红肉蜜柚（27）、曼赛龙（48）、皋泄香柚（4）、脆香甜柚（5）、早香柚（14）等8份材料组成;类群Ⅱ由处红柚（2）、福建文旦（56）、梁平柚（35）、虎蜜柚（36）等51份材料组成;类群Ⅲ由毛南本地柚（24）、越南小甜柚（45）组成;类群Ⅳ由越南小柚（44）、建阳橘柚（59）组成;类群Ⅴ由古巴柚（3）、星路比（19）、红马叙（20）、奥罗布郎柯（21）、火焰（22）组成。

2.3 遗传结构分析

基于SSR分子标记的数据分析群体结构表明，样本的等位变异频率特征类型数K呈折线图，当K=4时，△K值最大，据此将68份材料分为4个组群（图3）。

3 讨论

柑橘种间甚至属间易发生杂交，导致遗传背景复杂。该研究利用17对SSR引物对68份柚进行遗传背景研究，比较了68份样品的遗传亲缘关系，共检测到62条多态性条带，平均为3.647 0条。这62个多态性标记位点的等位变异数Na为2～5，总平均值为3.470 6;有效等位變异数Ne为1.076 2～3.504 4，总平均值为2.152 3;观测杂合度Ho为0.044 1～1，总平均值为0.454 2;期望杂合度He为0.071 4～0.764 8，总平均值为0.481 0;香农多样性指数I 为0.157 5～1.517 3，总平均值为0.848 2;多态信息含量（PIC）为0.068 3～0.723 0，平均PIC值为0.419 8。表明可以较好地揭示材料的遗传多样性。

从聚类分析图和结构图能直观地看出各材料间的亲缘关系，可以较好地对材料遗传背景进行预判。聚类分析结果显示无核沙田柚（1）和麻布文旦（6）亲缘关系较近，结构分析表明无核沙田柚和麻布文旦基因型也很相似，说明无核沙田柚可能不是沙田柚类型。李先信等[15] 用SRAP分子标记表明酸柚不能单独成为柚分类标准，此次试验结果酸柚（8）和梅州沙田柚（16）聚在一起，再次验证了前人的结论。在聚类分析中，泰国暹罗低酸柚（52）和泰国柚（54）遗传距离很近，并且都是扁圆形果形，果面光滑，低酸，推测这2个品种可能为同物异名的品种。黄肉蜜柚（26）和红肉蜜柚（27）亲缘关系较近，因为它们都是琯溪蜜柚的芽变品种[16]。前人根据表型数据进行主成分分析，显示垫江柚系列与沙田柚的亲缘关系较近[17]，此次研究结果显示垫江柚系列与长寿沙田柚具有很近的亲缘关系并有相同的基因型，从分子水平上说明了垫江柚系列可能属于沙田柚类型。经考证，梁平柚（35）最早从福建引入，此次试验中梁平柚和福建文旦（56）的亲缘关系比较近。聚类分析中，古巴柚（3）和4份葡萄柚（19、20、21、22）遗传距离很近，结构分析结果和聚类分析结果基本一致，董美超等[18]在《葡萄柚品种及遗传育种研究进展》一文中提到古巴柚是由古巴引进的葡萄柚，此次试验结果从分子水平上提供了证据。

4 结论

所选材料具有丰富的遗传多样性，聚类和结构分析的结果能直观地了解这68份材料的亲缘关系，并对其中可能的同物异名品种进行筛选。

参考文献

[1]张太平，彭少麟.柚的起源、演化及分布初探[J].生态学杂志，2000，19（5）：58-61，66.

[2] 叶荫民.柚Citrus grandis（L.）Osbeck种质多样化中心的探讨[J].中国南方果树，1997，26（1）：3-5.

[3] 刘勇，刘德春，吴波，等.柚类资源及其近缘种SSR标记的分子评价[J].应用与环境生物学报，2006，12（5）：628-634.

[4] RANA M K，SINGH S.Assessment of genetic diversity and DNA profiling of linseed （Linum usitatissimum subsp.usitatissimum L.） germplasm using SSR markers[J].J Plant Bioche Biotechnol，2017，26（3）：293-301.

[5] AHMED S，RATTANPAL H S，SINGH G.Diversity，characterization and evaluation in Pummelo （Citrus maxima Merr.） cultivars using SSR markers and quality parameters[J].Indian J Genet Pl Br，2019，79（3）：594-605.

[6] KONGSRI S，BOONPRAKOB U.Assessment of genetic relationships among pummelo cultivars [Citrus maxima （Burm.） Merrill] using simple sequence repeat markers[J].Maejo Int J Sci Tech，2016，10（2）：209-219.

[7] UZUN A，GULSEN O，YESILOGLU T，et al.Distinguishing grapefruit and pummelo accessions using ISSR markers[J].Czech J Genet Plant，2010，46（4）：170-177.

[8] 刘勇，刘德春，吴波，等.利用SSR标记对中国柚类资源及近缘种遗传多样性研究[J].农业生物技术学报，2006，14（1）：90-95.

[9] 雷天刚，何永睿，吴鑫，等.利用SSR标记鉴定柚和杂柑品种[J].分子植物育种，2007，5（5）：720-724.

[10] 刘冬峰，陈巍，林绍生，等.基于SSR标记的浙江地方柚类种质资源遗传关系分析[J].果树学报，2017，34（2）：166-174.

[11] 谢让金，邓烈.一种适合AFLP分析的柑橘DNA提取方法[J].生物技术，2007，17（6）：27-28.

[12] 李益，马先锋，唐浩，等.柑橘品种鉴定的SSR标记开发和指纹图谱库构建[J].中国农业科学，2018，51（15）：149-159.

[13] 王炯.基于COS Marker构建柑橘连锁图谱及作图群体的光合特性研究[D].重庆：西南大学，2017.

[14] EVANNO G，REGNAUT S，GOUDET J.Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE：A simulation study[J].Mol Ecol，2005，14（8）：2611-2620.

[15] 李先信，杨迎花，陈婕平，等.湖南柚种质资源的遗传多样性和亲缘关系[J].湖南农业大学学報（自然科学版），2013，39（4）：363-370.

[16] HE W Y，LI X Y，PENG Y，et al.Anti-oxidant and anti-melanogenic properties of essential oil from peel of pomelo cv. Guan Xi[J].Molecules，2019，24（2）：1-14.

[17] 刘勇，孙中海，刘德春，等.部分柚类品种数值分类研究[J].果树学报，2006，23（1）：35-40.

[18] 董美超，李进学，周东果，等.葡萄柚品种及遗传育种研究进展[J].亚热带植物科学，2018，47（2）：194-198.