范 师,杨 城,吴玲芳,何金芳,沈剑闻

(杭州中美华东制药江东有限公司,浙江 杭州 310014)

生物素又称VH和辅酶R,通常会与酶结合参与微生物体内二氧化碳的固定和羧化过程,与重要代谢过程如丙酮酸羧化而转变成为草酰乙酸,乙酰辅酶A羰化成为丙二酰辅酶A等糖及脂肪代谢中的主要生化反应有关[1-2],并且生物素为所有微生物所必需的生长因子,其用量对菌体的代谢、生长及繁殖等生命过程有较显著的影响,同时直接关系到细胞形态转变及细胞膜通透性[3]。冬虫夏草作为名贵真菌类中药,具有治疗肾虚、腰膝酸痛、久咳虚弱以及免疫调节等方面的功效。而中国被毛孢是冬虫夏草公认的无性型存在形式,几乎具有与冬虫夏草一样的药效和药性。由于天然冬虫夏草受制于季节、环境和地域等因素,产量较低,无法满足市场的巨大需求。因此,目前多采用深层低温发酵方式培养其菌丝体,以解决现有虫草药源匮乏的问题。

在实际工业化生产中,冬虫夏草菌发酵存在多种影响因素,其中氮源对菌体代谢影响尤为突出。经过长期的生产追踪和研究分析,笔者发现氮源中酵母膏成分对虫草菌的影响最大,为此需要探究酵母膏中潜在的主要影响因素。通过文献查阅,酵母膏作为虫草菌发酵的主要氮源之一,其不仅是重要的有机氮源,而且也是生物素的主要来源[4]。因此将生物素作为研究对象,同时在追溯酵母膏原料制备过程中,发现其原料来源、处理方法及生产工艺的不同,会使得不同批次间生物素质量浓度存在较大差异。鉴于生物素的重要生理功能,这种差异会对菌体生长产生较大影响,所以需要通过实验优化该物质的质量浓度,在酵母膏物料中建立有关参数指标,提高虫草菌的产量和质量水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 菌 种

冬虫夏草菌中国被毛孢(Hirsutellasinensis),保藏编号CCTCC NO.M 2018108,为华东医药自主筛选。

1.1.2 培 养 基

自制斜面培养基、种子培养基以及发酵培养基。

由于酵母膏中营养成分较为复杂,含有丰富的生物活性物质,为了减少对实验结果的干扰和判断,故培养基配方中均不加入酵母膏成分。

1.2 仪器与设备

R300抽滤泵;TS-100C摇床;DGG-9036A烘箱;HSY-22169坩埚;HH-4恒温水浴锅;SS-325型全自动灭菌锅;SW-CJ-1D超净台;FA2204B电子天平;BS-IE恒温恒湿培养箱;HYQ-310S医用冷藏箱;UV-5200紫外分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种培养与发酵

1)菌种斜面保存

将制备的斜面放入恒温恒湿培养箱,15 ℃培养30 d至菌丝成熟后,从恒温恒湿培养箱中收取,放医用冷藏箱保存。

2)菌种摇瓶活化

于无菌室中,将斜面菌块接入已准备好的摇瓶培养液中,每个摇瓶接入1支斜面,用4层纱布包好,将摇瓶棉塞塞回,在摇瓶机上15 ℃,100 r/min培养14 d。

3)生物素质量浓度梯度试验

先准备12个500 mL的锥形瓶,每个装200 mL左右的培养基,分别标记为1～6号,其中1号和2号瓶作为空白对照。3～6号瓶依次按50,100,300,500 μg/L配制出相应质量浓度的生物素溶液。以此作为基本溶液配制培养基,全部封口后,121 ℃灭菌30 min,冷却备用,为减少误差,每个实验组安排2个平行对照,记录实验数据并绘制柱状图。

4)菌种摇瓶发酵

在严格无菌条件下进行培养,其中菌体为适宜培养天数的活化种子液,以3%接菌量转接入备好的锥形瓶中,培养结束后,测菌体干质量、pH及甘露醇质量分数。通过分析实验组和对照组中3个参考指标之间的差异性,判断生物素潜在的应用与开发价值。

1.3.2 指标测定

1)菌体干质量测定

通过量筒准确量取150 mL发酵液,放入烘箱中干燥5 h,称重后计算干质量质量浓度,其计算式为

2)残渣和甘露醇质量分数测定

按照药典[5]说明,甘露醇质量分数采用高碘酸盐氧化法定量分析检测。

3)pH测定

梅特勒pH电极在线检测,pH精密试纸辅助矫正。

4)温度测定

温度电极在线检测。

1.4 数据处理

所有实验数据取3次实验的平均值。单因素方差分析之后Dunnettt检验确定数据差异的显著性(P<0.05,差异显著)。

2 结果与分析

利用单因素试验,以生物素质量浓度为自变量,pH为因变量,选择不同适宜生物素浓度,跟踪对应发酵pH的变化情况,形成的对应关系如图1所示。据文献报道[6-9],适量生物素可以促使菌体合成更多的磷脂分子,进而有效地增加谷氨酸和天冬氨酸在菌体内的积累,限制其向胞外渗透扩散;而滞留在菌体内的酸性氨基酸随着浓度的提高,会对相应脱氢酶形成顺序反馈抑制,减少丙酮酸脱氢进入三羧酸循环。从图1中可见:相比于对照组,在添加生物素后,摇瓶pH值有明显回升的趋势,且在实验质量浓度50～500 μg/L范围内,伴随生物素添加量的降低而升高。即菌体的产酸在不断减少,培养液的pH值下降趋势放缓。其中当生物素质量浓度维持在50 μg/L(P<0.05)左右时,胞外分泌的有机酸最少,此时溶液pH达到最大值。生物素质量浓度达到100 μg/L左右时,对应的pH=6.07,比对照组高出2%,虽然增幅不大,但是同样对实际生产会产生较明显的正面影响。基于大量生产数据的统计分析,pH值与虫草菌粉指纹存在必然关系,若pH<5,各核苷类物质的峰面积波动较大。对于pH介于5左右的发酵批次,小幅度的提高也会对指纹数据带来一定程度的积极影响。

图1 生物素添加量对发酵pH值的影响

利用单因素试验,以生物素质量浓度为自变量,干质量为因变量,选择不同适宜生物素质量浓度,跟踪对应批次菌体干质量的变化情况,形成的对应关系如图2所示。几乎所有的菌体在进行自身干物质合成并积累过程中,都离不开生化酶的协助和引导。其中用于CO2固定的关键酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶[10]与丙酮酸羧化酶,而这两种羧化酶均需要由生物素激活与调节,通过蛋白三维结构分析,发现生物素与羧化酶几乎镶嵌在一起[11],所以生物素在促进菌体合成代谢方面具有非常重要的应用价值。图2结果显示:生物素的适量使用的确有较显著的效果,随着生物素质量浓度的依次递减,菌体的干质量呈现先上升后下降的趋势,说明两者之间存在一定的规律性和关联性。当生物素质量浓度趋近100 μg/L时,菌体干质量质量浓度达到最大值(P<0.05),为7.43 g/L。生物素质量浓度的继续提升,则不利于菌体干物质质量的积累。但是相比于对照组,干质量仍然有所增加,说明生物素有利于促进菌体的生长代谢。

图2 生物素添加量对菌体产量的影响

利用单因素试验,以生物素质量浓度为自变量,甘露醇为因变量,选择不同适宜生物素质量浓度,跟踪对应批次甘露醇的变化情况,形成的对应关系如图3所示。生物素有利于提高菌体的产量和质量,尤其对于菌体代谢合成甘露醇等醇类物质方面,作为相应代谢途径中己糖激酶的主要辅酶[12],在协助和刺激生化酶发挥特定功能中扮演着举足轻重的角色,并且在一定程度上,通过各种途径,几乎影响着整个菌体的生命代谢过程。由图3可见:当生物素质量浓度超过300 μg/L时,相比于对照组,甘露醇质量分数虽然有一定程度的提高,但是增幅效果几乎不明显。而随着生物素浓度的不断降低,菌体内甘露醇合成量逐渐上升,当生物素质量浓度接近100 μg/L,胞内甘露醇质量分数达最大值(P<0.05),为0.58%。生物素质量浓度进一步降低,对应甘露醇质量分数则开始同步下降。同样地,相比对照组,不同生物素质量浓度都能有效促进并刺激菌体合成甘露醇。

图3 生物素添加量对甘露醇质量分数的影响

由图1～3可知:生物素质量浓度介于50～500 μg/L,菌体质量浓度随生物素添加量的提高,表现为先升后降的趋势,与甘露醇变化情况一致,而pH值则是平稳下降。另外,当生物素质量浓度接近100 μg/L时,菌体质量浓度和干质量及甘露醇质量分数依旧有增长的趋势。

3 结 论

基于对产量和质量水平影响的充分考量,初步确定生物素适宜质量浓度为100 μg/L。从整体实验反馈结果来看,如果合理地控制酵母膏中生物素质量浓度,不仅能提升虫草菌的产量,还能提高甘露醇的质量分数。因此,通过建立该指标的标准,提升冬虫夏草菌的生长代谢能力,从而提高生产水平和质量。由于酵母膏中活性成分非常复杂,除了生物素之外,类似其他B族维生素等生长因子的影响同样存在,后续进一步进行实验研究,以建立更多参数指标,为发酵冬虫夏草菌粉产量和质量提供更加强有力的保障。