韦建开，廖长秀2，陶莹，刘帅廷

(1. 右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000)

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球癌症死亡率中排名第四，占所有癌症死亡人数的8.2%[1]，是我国发病率和死亡率相对较高的恶性肿瘤之一。PLC属于高度免疫抑制型肿瘤，突变负荷和免疫原性较高，肿瘤边缘存在一定数量的T细胞浸润，但是肿瘤中心T细胞的数量一般较少，且浸润T细胞常常处于功能耗竭状态[2-3]。T细胞耗竭的主要特征为其表面负性共刺激分子表达水平升高，相关细胞因子分泌减少和效应T细胞杀伤能力下降，导致肿瘤细胞出现免疫逃逸而促进肿瘤的发生发展。因此，肝癌患者免疫负性共刺激分子的功能可能与肝癌发生密切相关。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)分子为重要的负性共刺激分子之一，多表达于活化的CD4+和CD8+T细胞。已经有研究发现，LAG-3的表达与PLC有相关性，且肝癌组织上的表达远高于癌旁组织[4]。在PLC患者TIL中的CD8+T细胞表面表达较外周血淋巴细胞显著增高。已有研究报道肝癌患者其他免疫负性共刺激分子如细胞程序性死亡受体-1(programmed death 1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与肝癌易感性密切相关[5-6]，但关于LAG-3 SNP与肝癌之间的关系尚未见报道。本文收集广西百色市及其周边地区PLC患者及健康对照者各300例，采用多重PCR及高通量测序法测定两组人群DNA LAG-3 rs1882545等位基因，分析两组人群LAG-3 rs1882545位点等位基因和基因型分布频率是否存在差异，以探讨LAG-3在肝癌发生发展中作用，为肝癌易感人群的筛选提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 查阅病例，收集籍贯为广西百色市或百色市周边并且于2018年9月—2020年7月在右江民族医学院附属医院住院的PLC患者300例，其中男性261例，女性39例，年龄为23～75岁，平均年龄为(51.2±11.1)岁，<55岁者191例，≥55岁者109例；同时收集肝炎项目检查正常即无肝炎性感染且AFP、AST、ALT、血常规各项指标正常300例为对照组，其中男性255例，女性45例，年龄为23～82岁，平均年龄为(51.9±9.0)岁，<55岁者184例，≥55岁者116例。两组对象在平均年龄、性别、年龄构成方面差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有入选样本均为互无血缘关系的广西百色市及其周边人群。根据知情同意原则，告知患者家属研究目的及风险等，取得同意并签署知情同意书，本研究经过右江民族医学院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采集外周血2 ml，按试剂盒说明采用倍沃医学科技公司血液基因组提取试剂盒(批号：231101200708)提取外周血白细胞中的基因组DNA。肝癌组样本所提取DNA浓度在11.50～338.20 ng/μl之间，对照组样本所提取DNA浓度大部分在10.65～349.75 ng/μl之间，提取所得的DNA完整性用琼脂糖电泳进行鉴定，所得DNA样本均符合送检要求。

1.2.2 LAG-3 rs1882545基因分型采用多重扩增及高通量测序方法进行 设计并合成好适合rs1882545 SNP位点的引物，上游引物为：5′-TGAGCCGTCTACATAAAACAGTTGA-3′，下游引物为：5′-GATAATACATCTCCTGAAGGCCAAT-3′。通过两步PCR的方法完成目标SNP位点序列的扩增和兼容Illumina测序文库的制备。第一轮PCR体系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、上游(10 μM)和下游引物(10 μM)各1 μl和2×PCR Ready Mix 15 μl(总体积25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。在PCR仪(BIO-RAD，T100TM)上执行扩增检测，循环参数设定如表1(第一轮第1次和第2次)，PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定产物大小正确，使用AMPure XP磁珠纯化回收PCR产物。然后以第一轮PCR产物为模板执行第二轮PCR反应，以获得测序带分子标签的文库。反应体系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、通用P7引物(含分子标签，10 μM)1 μl、通用P5引物(10 μM)1 μl和 2× PCR Ready Mix 15 μl (总体积30 μl)。配制好反应体系后，执行如下PCR程序如表1(第二轮)。最终PCR产物使用AMPure XP磁珠纯化回收，使用HiSeqXTen测序仪(Illumina, San Diego，CA)进行测序。设置软件参数，进行数据质控，筛选、删除、比对、分析等，得出目标基因型结果，再通过软件对突变位点进行基因注释。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。用拟合优度χ2检验检测基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用χ2检验先检测等位基因和基因型在PLC组和对照组的频率分布差异，用非条件Logistic回归计算比值比(odds rati，OR)及其95%可信区间(95%CI)评价各等位基因、基因型与PLC发生的关系。利用Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/)公布的5个地区人群(中国南方汉族、北京汉族、日本东京、尼日利亚和意大利亚托斯卡尼人群)基因多态性rs1882545位点基因型和基因分布频率结果，采用χ2检验分析广西百色市及其周边人群与这些人群该位点基因型和等位基因频率的分布差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 各步PCR循环参数设定情况

2 结果

2.1 健康对照人群LAG-3 rs1882545等位基因分布及与其他国家(地区)人群的比较 广西百色市及其周边健康对照人群LAG-3 rs1882545位点除1例未测出基因型，余299例DNA样本均测出，以G等位基因为主，占70.57%，GG、GA、AA 3种基因型分布频率分别为50.50%、40.13%、9.37%，符合Hardy-Weinberg平衡。LAG-3 rs1882545位点基因型和等位基因频率与中国南方汉族和尼日利亚人群比较差异无统计学意义(P>0.05)，但与北京汉族、日本东京、意大利托斯卡尼比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 不同种族及地区人群LAG-3 rs1882545位点多态性分布频率的比较

2.2 PLC人群LAG-3 rs1882545等位基因分布与健康对照人群的比较 广西百色市及其周边PLC人群300例DNA样本均测出LAG-3 rs1882545位点等位基因，GG、GA、AA 3种基因型分布频率分别为45.00%、45.67%、9.33%，符合Hardy-Weinberg平衡。χ2检验比较两组基因型及等位基因rs1882545分布频率，发现两组差异无统计学意义(P>0.05)。经非条件Logistic回归分析，校正性别和年龄因素后结果显示，rs1882545基因型和等位基因分布频率与PLC的患病风险均无关(P>0.05)。结果见表3。

表3 LAG-3 rs18825454与PLC患病风险的关系

2.3 LAG-3 rs1882545与PLC易感性的分析 性别分层分析中男性及年龄分层(<55岁和≥55岁)PLC组和健康对照组LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)，经非条件Logistic回归分析，也与PLC的患病风险均无关(P>0.05)。结果见表4和表5。广西百色市及其周边地区女性PLC组和相应健康对照组LAG-3 rs1882545基因型分布频率无统计学差异，但女性PLC组A等位基因频率明显高于相应健康对照组，经χ2检验计算(χ2=4.146，P=0.042)，提示女性携带A基因与患PLC有关；经非条件Logistic回归分析，发现女性人群与患PLC的风险有关联(P=0.042，OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)，提示携带A等位基因患肝癌相对本次实验健康人群的风险增加，见表4。

表4 LAG-3 rs18825454与PLC患病风险的性别分层分析

表5 LAG-3 rs18825454与PLC患病风险的年龄分层分析

3 讨论

本研究收集广西百色市及其周边PLC患者300例，对其进行年龄和性别分层时发现<55岁年龄的人群为主，占比为63.67%，同时以男性患者居多(87.00%)，这与林子博等[7]学者报道的广东顺德地区PLC人群男性患者为主且年龄在22～55岁居多相一致。众所周知慢性乙型病毒性肝炎(乙肝)是PLC发病的独立危险因素[8]；刘慧妮[9]曾报道广西百色市乙肝感染人群以男性居多，而且年龄以20～55岁占大比例，提示慢性乙肝可能是广西百色市及其周边人群PLC患者以男性居多且呈年轻化的原因。这与文献报道我国肝癌患者男性远高于女性，年龄呈年轻化，已由原来的40～50岁提前至35～50岁的结果相一致[10]。

LAG-3也称CD223，分子量为70 kDa，定位于人12号染色体 (12 p13.3)。作为免疫检查点家族的一员，LAG-3是T细胞功能的抑制性分子，多种肿瘤微环境中有异常表达，参与肿瘤的免疫逃逸，进一步促进肿瘤的发生发展[11]。有研究报道肝癌肿瘤浸润淋巴细胞上LAG-3阳性表达为65.00%，可能在肝癌发生发展中具有重要的作用[12]。已知SNP可使基因结构或表达量发生变化，在个体对某些药物的反应、对环境因素(如毒素)的敏感性、发展特定疾病的风险(特别是个体肿瘤遗传易感性)等方面发挥重要的作用[13]。目前研究LAG-3基因多态性较少。已有研究报道LAG-3 rs19922452、rs951818和rs870849基因多态性与多发性硬化的易感性相关，rs19922452 TT、rs951818 GG和rs870849 CT基因型使多发性硬化的风险降低[14]。刘爱娟[15]通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析CD4基因rs2515733多态性位点基因频率和LAG-3基因rs870849多态性位点基因频率在特发性血小板减少性紫癜患者组与对照组之间无显著差异。这些研究表明LAG-3的不同位点在同一疾病、同一个位点与不同疾病的关联性均具有差异性。

本研究收集广西百色市及周边健康对照者和PLC患者各300例，采用多重扩增及高通量测序测定LAG-3 rs1882545位点等位基因。结果发现广西百色市及其周边健康对照人群LAG-3 rs1882545位点，以G等位基因为主，占70.57%，GG、GA、AA 3种基因型分布频率分别为50.50%、40.13%、9.37%，基因型和等位基因分布频率与中国南方汉族和尼日利亚人群比较差异无统计学意义，提示本研究的基因分型方法具有一定的可信性。本研究结果也发现本文健康对照人群LAG-3 rs1882545基因型和等位基因分布频率与北京汉族、日本东京、意大利托斯卡尼比较差异有统计学意义，提示LAG-3rs1882545基因多态性具有种族和地域差异。

本研究发现虽然在不分层或年龄分层或男性广西百色市及周边人群LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布频率 PLC患者与健康对照患者比较差异无统计学意义，但在女性人群中PLC患者A等位基因频率(42.31%)明显高于健康对照人群(27.27%)，差异有统计学意义，且携带A等位基因患PLC风险明显增加(OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)。由于纳入本次研究的女性病例数较少，需要增加更多的女性病例数进一步来确认其相关性。

综上所述，本研究发现在广西百色市及其周边人群中以男性年龄25～55岁为主，LAG-3 rs1882545基因型、等位基因分布频率具有种族和地域差异，LAG-3 rs1882545 A等位基因可能与广西百色市及其周边女性人群PLC易感性有关，为广西百色市及其周边地区女性肝癌易感人群的筛选提供一定的理论依据。由于本次研究病例来源和病例数的局限性，需要后续增加病例数来进一步深入研究。