(右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床上常见的急腹症，该病起病急，并发症多，病情重，病死率高达20%，部分病人可遗留不同程度的胰腺功能不全[1-2]。近年来，虽然SAP在诊疗措施方面取得了很大进展，然而其病死率仍居高不下，与其发病机制不明有关。既往研究认为全身炎症反应综合征是SAP死亡的主要原因，但近年研究发现SAP淋巴细胞过度凋亡，引起免疫抑制和感染并发症的发生，是导致患者病情加重及死亡的重要原因[3-4]。然而SAP淋巴细胞凋亡的机制尚不清楚。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group protein 1，HMGB1)是一个经典的损伤相关模式分子，可由细胞主动分泌或被动释放，通过与一系列分子相互作用而引起机体生理或病理改变。HMGB1表达增加可导致细胞凋亡增加，与多囊卵巢综合征内分泌失调、认知功能障碍、SAP相关性心肌损伤等疾病的发生发展密切相关[5-7]，然而HMGB1在SAP淋巴细胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通过腹腔注射雨蛙素和脂多糖(LPS)诱导SAP小鼠模型，检测HMGB1表达情况，分析HMGB1表达与脾淋巴细胞凋亡率及凋亡标志物Caspase-3表达的相关性，探讨HMGB1与SAP脾淋巴细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雄性SPF级BALB/C小鼠30只，体重25～30 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司；雨蛙素(C9026，Sigma)；LPS(L2880，Sigma)；抗HMGB1多克隆抗体(ST326052233)；脂肪酶和淀粉酶的测定试剂盒购自南京建成公司；HMGB1 ELISA试剂盒(CSB-E08225m，华美)；Caspase-3 ELISA试剂盒(CSB-E08858m，华美)；AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(AP-MN-MS-RNA-50G)；FastKing RT Kit(With gDNase)(KR116-02，Tiangen)；SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(FP205-02，Tiangen)；PCR引物合成(上海捷瑞)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(556547，BD公司)；红细胞裂解液(R1010，Solarbio)。

1.2 动物分组与建模 采取随机数字表法将小鼠分为对照组、SAP组、SAP+Ab组。小鼠在试验前均给予禁食12 h和自由饮水处理。对照组10只，给予腹腔注射0.9%的氯化钠水溶液。SAP组10只，采用腹腔注射雨蛙素+LPS[雨蛙素50 μg/(kg·h)，共13次，在注射雨蛙素后，立即向腹腔内注射LPS，LPS给药剂量30 mg/kg]。SAP+Ab组10只，于SAP造模后腹腔注射HMGB1特异性抑制剂抗-HMGB1抗体10 mg/kg。观察各组小鼠的生理活动、生命征、死亡情况。造模后12 h处死取材。

1.3 标本采集及检测 水合氯醛麻醉小鼠后行眼眶采血，待血液静置凝固后于4℃ 3000 r/min离心15 min，取上清液，EP管分装后置于-80℃冰箱保存用于脂肪酶、淀粉酶和ELISA检测。采血后将以颈椎脱臼法处死小鼠，取出脾脏置于1640培养基中，用于分离淋巴细胞进行流式细胞术检测及PCR检测。取胰腺组织放入装有10%甲醛溶液的50 ml离心管中固定，随后送病理科做HE染色。

1.3.1 HE染色 胰腺组织先用10%甲醛进行固定过夜，然后进行脱水，用石蜡包埋处理后即可进行石蜡切片，苏木精和伊红染色。请2位资深病理科医生双盲阅片，根据改良的Schmidt法[8]和Pozsar法[9]评分标准进行胰腺的损伤评分：①水肿： 0=无水肿，1=叶间隙轻度增宽，2=叶间隙重度增宽，3=腺泡间隙增宽，4=细胞间隙增宽；②坏死： 0=无，1=坏死面积为1%～10%，2=坏死面积为11%～20%，3=坏死面积为21%～30%，4=坏死面积>30% ；③出血： 0=无，1=有；④炎性细胞浸润(计数高倍镜视野下血管周围或小叶内白细胞数量)：0=0～1个，1=2～10个，2=11～20个，3=21～30个，4= 30个以上或出现微脓肿。每张切片随机选5个高倍视野计数。

1.3.2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的检测 从-80℃冰箱取出备用的小鼠血清并适当稀释后，根据试剂盒使用说明书严格操作，用分光光度计测定各组的OD值并计算出各组血清中淀粉酶浓度(淀粉-碘比色法)和脂肪酶浓度(比色法)。

1.3.3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3的检测 从-80℃冰箱取出各组备用的小鼠血清，采用ELISA试剂盒说明书的方法，用ELISA试剂盒检测HMGB1和Caspase-3的表达水平。

1.3.4 流式细胞术检测 取小鼠脾脏，200目尼龙膜研磨，经红细胞裂解液处理后收集淋巴细胞；将上述淋巴细胞以PBS配成浓度为1×106/ml的细胞悬液，用移液枪吸取上述细胞悬液200 μl，加入AnnexinV-FITC、PI各10 μl，置于室温、黑暗的环境中孵育15 min，加入1×buffer 400 μl，立即上流式细胞仪去检测脾淋巴细胞凋亡率。

1.3.5 脾淋巴细胞RT-PCR检测 检测按照说明书所述步骤提取各实验组脾淋巴细胞的总RNA，经紫外分光光度计(TU-1810PC，北京普析)测定OD260、OD280及浓度。取1 μg总RNA用反转录试剂盒并按说明书方法进行反转录获得cDNA单链，并保存在-80℃。应用SYBR Green Master Mix扩增上述cDNA，使用LightCycler○R96 qPCR仪进行检测。HMG-B1引物序列：上游5′-AGGCGAGCATCCTGGCTTATC-3′，下游5′-CCTTCAGCTTGGCAGCTTTCT-3′。Caspase-3引物的序列：上游5′-CTGACTGGAAAGCCGAAACTC-3′，下游5′-CCCACTGTCTGTCTCAATGCC-3′。GAPDH引物的序列：上游5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。记录GAPDH、HMGB1、Caspase-3的Ct值。所有样品均设3个复孔，取均值并采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 小鼠胰腺病理评分比较 对照组胰腺腺泡结构基本完整，部分视野偶见水肿或少许炎性细胞；SAP组可见胰腺腺泡细胞大量坏死，腺泡结构严重破坏，部分腺泡呈孤岛状，大部分胰腺腺叶正常结构消失，腺泡的间隔以及小叶的间隔均变宽，间质内可见红细胞和炎症细胞大量渗出。与SAP组相比，SAP+Ab组胰腺的坏死、水肿、炎症细胞和红细胞渗出显著减少。根据改良的Schmidt法和Pozsar法评分标准，与对照组相比，SAP组和SAP+Ab组的胰腺病理组织学评分均增加；与SAP组相比，SAP+Ab组的胰腺病理组织学评分降低(P<0.05)，见表1、图1。

图1 小鼠胰腺组织病理改变 (HE400×)

表1 小鼠胰腺组织评分比较

2.2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平比较 与对照组相比，SAP组和SAP+Ab组血清中的淀粉酶水平均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与SAP组相比，SAP+Ab组血清中的淀粉酶水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，SAP组和SAP+Ab组血清中的脂肪酶水平均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与SAP组相比，SAP+Ab组血清中的脂肪酶水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平比较 单位：U/L

2.3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3水平比较 与对照组相比，SAP组和SAP+Ab组血清HMGB1水平均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与SAP组相比，SAP+Ab组血清HMGB1水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，SAP组和SAP+Ab组血清Caspase-3水平均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与SAP组相比，SAP+Ab组血清Caspase-3水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4 小鼠脾淋巴细胞凋亡率 在双变量流式细胞仪的散点图上，以Annexin-V FITC、PI分别为散点图的横纵坐标。图中左下象限Q4(FITC-/PI-)显示活细胞；右上象限Q2(FITC+/PI+)代表坏死细胞；而右下象限Q3(FITC+/PI-)代表早期凋亡细胞。与对照

表3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3水平比较 单位：ng/ml

组对比，SAP组和SAP+Ab组脾淋巴细胞凋亡率均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，与SAP组相比，SAP+Ab组脾淋巴细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4、图2。

表4 小鼠脾淋巴细胞凋亡率比较

图2 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞凋亡率

2.5 小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA和Caspase-3 mRNA相对表达量 与对照组对比，SAP组和SAP+Ab组HMGB1 mRNA表达均升高(P<0.05)；与SAP组比较，SAP+Ab组HMGB1 mRNA表达下降(P<0.05)。与对照组对比，SAP组和SAP+Ab组Caspase-3 mRNA表达均显著升高(P<0.05)；与SAP组对比，SAP+Ab组Caspase-3 mRNA表达降低(P<0.05)，见图3。

HMGB1 mRNA表达水平

Caspase-3 mRNA表达水平

2.6 小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平与脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平的相关性 SAP组小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平与脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈正相关(r=0.9793、r=0.9405、r=0.9191，r=0.9716、r=0.9653、r=0.9705，P<0.05)，随着HMGB1 mRNA和血清HMGB1表达水平增高，脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA和血清Caspase-3升高，见图4。

图4 SAP组小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平与各指标的相关性

3 讨论

SAP早期表现为强烈的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，后期常并发感染以及多器官功能障碍(multiple organ dysfunction，MODS)[10]。外周血淋巴细胞是免疫系统的关键组成成分。淋巴细胞过度凋亡引起免疫抑制是SAP后期患者感染及死亡的重要原因[4]。本课题组的前期研究也证实了淋巴细胞Fas和Fas配体表达增加，导致淋巴细胞过度凋亡，与SAP严重程度、免疫抑制及继发感染等密切相关[3，11]。

细胞凋亡也称Ⅰ型程序性死亡，是细胞在生理和病理条件下发生的系统且协调的死亡过程[12]。细胞凋亡依据其发生过程是否依赖蛋白酶Caspases分为Caspases依赖性细胞凋亡和Caspases非依赖性细胞凋亡两种。Caspase依赖性细胞凋亡最终都可导致Caspase-3酶原的激活，其与细胞凋亡的执行阶段的开始密切相关[13]。HMGB1是一种在真核生物中普遍存在的、多功能的、与DNA结合的非组蛋白。HMGB1在细胞外主要是通过晚期糖基化终产物受体、Toll样受体4和CXC基序趋化因子受体4相互作用而发挥生物学效应。研究表明HMGB1与细胞凋亡密切相关[5-7]。Zhu HL等[5]在实验中发现通过抑制lncRNA ZFAS1/miR129/ HMGB1信号轴可以减少卵巢颗粒细胞凋亡，从而减轻多囊卵巢综合征内分泌功能混乱。Shi Y等[7]也证实了HMGB1也可通过其他途径导致细胞凋亡增加，他们在共培养Transwell系统中，发现HMGB1通过减少PI3K/Akt/Gsk3β信号通路中的Akt和Gsk3β的磷酸化引起海马神经元凋亡增加和认知功能障碍。Wen Y等[6]在SAP大鼠中观察到HMGB1可促进心肌细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表达来增加活性氧的释放，最终导致凋亡相关蛋白Caspase-3的表达，SAP大鼠的心肌细胞凋亡增加，加重心肌损伤。上述研究表明HMGB1可能通过调控细胞凋亡参与疾病的发生、发展。周淼等[14]采用胰胆管逆行注射5%的牛磺胆酸钠建立SAP大鼠模型，发现SAP组大鼠回肠组织中的HMGB1 mRNA较对照组显著升高、同时T淋巴细胞凋亡率也比对照组大鼠显著增加，提示HMGB1可能通过调节T淋巴细胞凋亡参与SAP时肠免疫功能障碍的发生。然而HMGB1对SAP脾淋巴细胞凋亡的调控作用尚不清楚。

本研究结果显示SAP组小鼠胰腺腺泡细胞大量坏死，腺泡结构严重破坏，并且有大量红细胞和白细胞渗出；同时观察到血清淀粉酶和脂肪酶显著升高，表明腹腔注射雨蛙素和LPS成功复制小鼠SAP模型。本研究发现SAP组脾淋巴细胞HMGB1 mRNA和血清HMGB1表达水平较对照组显著增加。同时，SAP组小鼠脾淋巴细胞凋亡率及Caspase-3 mRNA表达水平和血清Caspase-3表达水平均较对照组显著升高，这与我们课题组前期研究证实了SAP中脾淋巴细胞凋亡增加的结果一致[15]。提示SAP脾淋巴细胞凋亡增加可能与HMGB1高表达有关。为进一步探讨HMGB1基因表达对脾淋巴细胞凋亡的调节作用，我们将SAP组小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1表达水平与脾淋巴细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平分别进行相关性分析，结果发现，SAP组小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平与脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈正相关，随着HMGB1 mRNA和血清HMGB1表达水平增高，脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA和血清Caspase-3表达水平升高。提示HMGB1对SAP小鼠脾淋巴细胞的凋亡起正向调节作用。为了进一步证实HMGB1对脾淋巴细胞凋亡的调控作用，我们设置了SAP+Ab组，在SAP小鼠造模后予抗-HMGB1抗体干预，抑制HMGB1的表达，发现脾淋巴细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3表达水平表达降低，证明抑制HMGB1的表达可减轻脾淋巴细胞凋亡，从而改善机体的免疫功能。然而在SAP中HMGB1对脾淋巴细胞凋亡的具体作用机制有待于未来进一步研究。

综上所述，我们的研究发现SAP组小鼠脾淋巴细胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1表达显著增加，脾淋巴细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA及血清Caspase-3表达水平显著升高，HMGB1mRNA、血清HMGB1水平与脾淋巴细胞凋亡率、脾淋巴细胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈显著正相关，提示HMGB1对SAP小鼠脾淋巴细胞凋亡起重要的调节作用，可能是由于HMGB1高表达，引起淋巴细胞过度凋亡，导致SAP免疫抑制的发生。这表明HMGB1可能是一个潜在的治疗靶点，通过阻断HMGB1表达将可能减少淋巴细胞凋亡，从而改善SAP患者的免疫功能。