基于orthogonal design优选墓头回中总多糖含量测定条件*

2021-03-17王嘉琛张莉丹王伊楠郭宇航董征艳姚隆丹段秀俊

广州化工 2021年5期

王嘉琛，张莉丹，王伊楠，郭宇航，董征艳，姚隆丹，段秀俊

(1 山西药科职业学院，山西太原 030031;2 山西中医药大学，山西太原 030031)

墓头回始载于李时珍的《本草纲目》，是败酱科败酱属植物糙叶败酱PatriniascabraBunge和异叶败酱PatriniaheterophyllaBunge的根茎或全草，性凉，味苦、微酸涩，具有燥湿止带、收敛止血、清热解毒的功效[1]。现代研究发现墓头回中含有丰富的多糖类活性成分，并具有提高机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗癌等[2-6]多种作用。近年来对墓头回中有效成分分离与提纯等方面都取得了较大进展，但是对墓头回中总多糖含量的测定较为少见，因此本实验对墓头回中多糖的显色条件进行优化，并对不同产地墓头回中总多糖的含量进行测定。

1 材料与仪器

UV-610S紫外-可见分光光度计，上海元析仪器责任有限公司；KQ5200V超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；7D5A-WS离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；UW120D十万分之一电子天平，岛津；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

墓头回药材10批，均购自安徽亳州，为败酱科败酱属植物糙叶败酱，产品信息情况见表4由山西中医药大学段秀俊副教授鉴定为正品；浓硫酸；苯酚(批号：20150506)，购于天津市风船化学试剂科技有限公司；D-葡萄糖标准品(批号：110833-201205)，购于中国食品药品检定研究院；无水乙醇(批号：20190408)，购于天津市北辰方正试剂厂。

2 方法与结果[7-8]

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品10.25 mg，加水溶解并定容至50 mL，做为对照品母液(浓度0.205 mg/mL)。精密吸取对照品母液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，制成浓度为0.0513 mg/mL的葡萄糖对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

取墓头回粉末(过五号筛)约0.1 g，精密称定，置50 mL圆底瓶中，加水5 mL，100 ℃回流60 min，放至室温，加水补足减失的质量，滤过，加无水乙醇至乙醇体积分数为65%，摇匀，置4 ℃冰箱静置12 h，离心(转速设定3500 r/min，10 min，下同)，取沉淀加65%乙醇5 mL洗涤1次，离心，取沉淀物加水使溶解，定容到100 mL容量瓶中，即得。

2.2 检测波长的选择

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2.0 mL，各加入具塞试管中加入7%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴冷却5 min，置沸水浴中加热15 min，再置于冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，分别用全波长扫描二者的紫外吸收图谱，显示二者在489 nm处均有最大吸光度，故选489 nm为最大吸收波长。

2.3 墓头回中总多糖含量测定显色条件的优化[9]

2.3.1 单因素实验考察

2.3.1.1 苯酚浓度对墓头回中总多糖含量测定结果的影响

精密吸取“2.1.2”项下溶液2.0 mL供试品溶液5份，于具塞试管分别中加入浓度为5%、6%、7%、8%、9%的苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冰水浴冷却5 min后，置沸水浴中加热15 min，再置于冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，于489 nm测定吸光度，以苯酚浓度为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，结果见图1。

图1 苯酚浓度对于吸光度的影响

2.3.1.2 显色反应温度对墓头回中总多糖含量测定结果的影响

精密吸取“2.1.2”项下溶液2.0 mL供试品溶液5份，于塞试管中加入7%苯酚溶液1 mL摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冰水浴冷却5 min后，分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴中加热15 min，再置于冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，于489 nm测定吸光度，以显色温度为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，结果见图2。

图2 显色温度对于吸光度的影响

2.3.1.3 显色时间对墓头回中总多糖含量测定结果的影响

精密吸取“2.1.2”项下溶液2.0 mL供试品溶液5份，于具塞试管中加入7%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴冷却5 min，置沸水浴中分别加热5、10、15、20、25 min，再置冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，于489 nm测定吸光度以显色时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，结果见图3。

图3 显色时间对于吸光度的影响

2.3.1.4 静置时间对墓头回中总多糖含量测定结果的影响

精密吸取“2.1.2”项下溶液2.0 mL供试品溶液5份，于具塞试管中加入7%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴中分别冷却0.5、5.5、10.5、15.5、20.5 min，置沸水浴中加热15 min，再置于冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，于489 nm测定吸光度以静置时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，结果见图4。

图4 静置时间对于吸光度的影响

2.3.1.5 单因素实验结果分析

通过对苯酚浓度、显色时间、显色温度、静置时间四个单因素对墓头回中多糖显色结果的考察，发现苯酚浓度、显色时间、显色温度对显色结果影响较大，而静置时间对结果影响并不明显，故选择苯酚浓度、显色时间、显色温度这个三个因素，进行正交实验考察。

2.3.2 正交实验法优选显色条件

以墓头回中总多糖的含量测定结果为考察指标，选择对显色条件影响较大的三个显色时间、显色温度、苯酚浓度做为考察因素，每因素设定三个水平，采用L9(34)表进行正交实验，因素与水平安排见表1，分别按表2中的九组条件进行正交实验，并对实验结果进行了方差分析，结果见表3。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验表及结果

表3 正交实验方差分析表

由表2可见，最高分的组合为正交4实验，由此得出的最佳工艺组合为A2B1D3。由表3的正交实验方差分析表可知，影响吸光度顺序为：A(显色时间)>B(显色温度)>D(苯酚浓度)，且A对总多糖的显色条件有显著性影响(P<0.05)，B、C没有显著性影响(P>0.05)，得出的最佳组合为A2B1D3。因此综合分析，最佳的实验条件，即苯酚浓度为9%，水浴温度为70 ℃，加热时间为10 min。

2.4 方法学考察[8]

2.4.1 墓头回总多糖的测定法

根据单因素实验及正交实验结果，精密吸取供试品溶液或对照品溶液2.0 mL，于具塞试管中加入9%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置于70 ℃水浴中加热10 min，再置于冰水浴中冷却5 min，以随行试剂作空白对照，于489 nm测定吸光度。

2.4.2 线性关系的考察

精密吸取“2.1.1”项下对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置具塞试管中，蒸馏水补充体积至2.0 mL，加入9%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，置70 ℃水浴中，加热显色10分钟后立即取出，置冰水浴冷却5 min；精密吸取蒸馏水2 mL同上述操作，作为空白对照，于489 nm测定吸光度。以浓度(x)为横坐标，以吸光度(y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=13.76x+0.0349，R2=0.9997。结果表明，无水葡萄糖溶液在0.00257-0.0513 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度考察

精密吸取“2.1.1”项下D-葡萄糖对照品溶液，按“2.4.1”项下方法连续测定6次吸光度，得RSD为1.13%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性考察

取1份供试品溶液，按“2.4.1”项下方法每隔10 min，测定吸光度并计算RSD值，RSD为2.1%，表明供试品溶液在1 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性考察

取6份供试品溶液，按“2.4.1”项下方法分别测定吸光度值，计算RSD值为2.49%，表明本法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察

精密称取已知总多糖含量的墓头回多糖粗粉6份，每份约为0.05 g，按样品中含量加入适量D-葡萄糖对照品，依法测定含量，计算回收率，结果见表4，得加样回收率均值为99.75%，RSD为2.02%，RSD<3%，表明本法准确性好。

表4 加样回收率考察结果

2.4.7 不同产地批次的墓头回含量测定

精密称取不同产地批次的墓头回药材粉末10份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.4.1”项下方法显色并重复测定总多糖含量。结果见表5。

表5 不同产地批次的墓头回含量测定结果

3 讨论

现代研究表明，墓头回具有抑菌、抗癌、抗氧化、增强机体免疫的功效[9-11]。无论是对于小鼠移植性肝癌肿瘤的抑制[12]亦或对于体外肺源腺癌细胞SPCA-1、人肝癌细胞系HepG2、和人慢性髓系白血病细胞K562的杀灭[13]，均有良好的作用。但研究多集中于多糖的作用，对于不同产地的墓头回中多糖的含量及最优的显色条件并无文献报道，故本文对此进行研究。

本文选取了苯酚浓度、显色时间、显色温度、静置时间四个单一因素对墓头回多糖的显色结果进行考察，发现苯酚浓度、显色时间、显色温度对显色结果影响较大。随后进行L9(34)正交实验，优选了最佳实验条件。并进行了严密的方法学考察，证明此方法严谨可行，为墓头回多糖的测定提供了一种有效可行的方法。