伍建中，颜玮韬，张雨云，周晓波，陈 嘉，张 瑱，葛 建

(1 大理大学，云南省昆虫生物医药研发重点实验室/药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心/中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南 大理 671000;2 上海华汇拓医药科技有限公司，上海 201203)

快乐鼠尾草(SalviasclareaL.)，别名欧鼠尾草，香紫苏，为唇形科，鼠尾草属草本植物。精油蒸馏自其叶子与花朵，带有些甜味及茴香、樟脑的香味。在国外用来调味，防腐等[1-2]。国外学者报道快乐鼠尾草精油有效成分主要为挥发油，酚类、酚酸及其衍生物[3]等；其药理作用主要包括，抗氧化，抗菌和抗炎镇痛等[3]，是一种重要的天然医药资源。但因为不同厂家工艺的差异。导致快乐鼠尾草精油的组成成分和药理活性也有一定不同。因此实验对选取国内三种厂家快乐鼠尾草精油，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其进行分析和峰面积归一化法计算各成分相对含量，并对三种厂家快乐鼠尾草精油进行抑菌和抗炎活性评价，以期为其进一步的开发利用提供一定的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

7890A GC/5975C MS气相色谱-质谱联用仪器，美国Agilent Technologies公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；BSA-124S型精密分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；HF160W型水套式二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；201型奥地利安图斯2010酶标仪，奥地利安图斯公司。

1.2 试 药

青链霉素(100×，批号：20190712)，Solarbio公司；氯霉素注射液(批号：1906318)，国药集团荣生制药有限公司；克霉唑溶液(批号：E1009)，白云山何济公制药厂；快乐鼠尾草精油分别购于云南大理A(批号20180605)、云南西双版纳B(批号20190411)、广西南宁C(批号20190320)，规格均为10 mL。

脂多糖(批号：NO.320V035)，北京索莱宝科技有限公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(批号：2009115)，Gibco公司；RPMI-1640(批号：1833738)，Gibco公司；Fetal Bovine Serum(批号：1828728)，Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO，色谱级，批号：201608206)，天津市福晨化工厂公司；小鼠细胞上清肿瘤坏死因子-α(批号：M1090729-102a)，欣博盛生物科技有限公司；营养琼脂培养基(批号：180726)，北京陆桥技术股份有限公司；沙氏琼脂培养基(批号：705K021)，北京索莱宝科技有限公司。

金黄色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(25923)、大肠埃希菌Escherichiacoli(25922)、白色念珠菌Candidaalbicans(10231)，由大理大学基础医学院提供；小鼠白血病巨噬细胞RAW264.7，F5(广州，KCB200603YJ)。

2 方 法

2.1 快乐鼠尾草精油GC-MS定性分析

2.1.1 GC-MS分析样品制备

称取快乐鼠尾草精油适量，以甲醇配制成浓度为3 mg·mL-1的供试品溶液，使用孔径为0.22 μm的聚醚砜针式过滤器过滤，备用。

2.1.2 GC-MS分析条件

色谱条件：Agilent气相色谱柱(HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm)；色谱工作站OpenLab CDS ChemStationC.01.01；载气为氦气；载气流速1.0 mL·min-1；进样体积0.3 μL；以分流比10:1分流进样；梯度升温程序见表1；分析时间34 min。

质谱条件：EI 离子源，离子源温度230 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围m/z 50～550；质谱检索采用NIST11.L标准谱库检索，各组分的相对百分含量采用峰面积归一化法计算。

表1 梯度洗脱程序

2.2 快乐鼠尾草精油抑菌实验

2.2.1 菌悬液的制备

取一只无菌试管，用注射器抽取4 mL 0.9%无菌生理盐水，注入到试管中。用接种环挑取待测菌种1～2个单个菌落，制成菌悬液，与0.5麦氏比浊液比浊(约含菌1.5×108CFU·mL-1)，整个操作在20 min内完成。

2.2.2 阳性药的制备

氯霉素溶液：将氯霉素注射液2 mL 0.25 g加入8 mL生理盐水配制成10 mL浓度为0.05 g·mL-1的母液，备用；

克霉唑溶液：将1 mL 15 mg·mL-1的克霉唑溶液加入9 mL生理盐水配制成10 mL浓度为1.5 mg·mL-1的母液，备用。

2.2.3 牛津杯法测定抑菌活性[4]

将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，待其凝固后将适量的菌悬液均匀地涂在培养基表面。在培养基表面直接垂直放上牛津杯。轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入样品。分组如下：阳性对照组氯霉素溶液1.563 mg·mL-1、0.781 mg·mL-1、0.391 mg·mL-1、0.195 mg·mL-1，0.098 mg·mL-1。克霉唑溶液1.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、0.375 mg·mL-1、0.1 875 mg·mL-1、0.009375 mg·mL-1。阴性对照组为生理盐水，给药组为200 μL不同厂家的快乐鼠尾草精油。加药后将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌置于温培养箱中孵育24 h，白色念珠菌置于恒温培养箱中孵育48 h。用游标卡尺测定抑菌圈直径。每组重复三次，结果取平均值。

2.3 快乐鼠尾草精油的抗炎实验[5]

将RAW264.7细胞以1×105个/孔于96孔板接种并分为：阴性对照组、模型组(LPS)、给药组(LPS+不同浓度精油)，37 ℃，0.5%CO2培养24 h 后，除阴性对照组外，其余各组均加入LPS使其终浓度为1 μg·mL-1LPS刺激4 h，实验组进行以下处理：阴性对照组和LPS模型对照组给予PBS缓冲溶液10 μL，给药组分别加入三种不同品牌的快乐鼠尾草精油，使其终浓度为高剂量(30 μg·mL-1)、中剂量(15 μg··mL-1)、低剂量(7.5 μg·mL-1)，每组6个复孔，培养24 h后收集细胞上清液，采用ELISA法检测上清液中TNF-α的含量。

2.4 数据处理

3 结 果

3.1 快乐鼠尾草精油GC-MS成分分析结果

按照上述“2.1”进行实验，得到快乐鼠尾草精油的总离子流图，见图1～图3；质谱检索采用 NIST11. L 标准谱库并结合相关文献[6-8]。为扣除噪音干扰，本研究采用提取离子的方法对空白溶液与快乐鼠尾草精油供试品溶液图谱进行处理。设定提取离子波动范围±0.5u，化合物鉴定方法如上所述，如提取离子m/z 136，快乐鼠尾草精油供试品溶液图谱如图1所示。快乐鼠尾草精油供试品溶液图谱中于12.652 min处出现一差异峰，通过与对照品及NIST11. L数据库比对，该化合物最终被确定为d-柠檬烯。成分鉴定结果见表2。

图1 A快乐鼠尾草精油总离子图

图2 B厂家快乐鼠尾草精油总离子图

图3 C快乐鼠尾草精油总离子图

表2 快乐鼠尾草精油中的主要化学成分

续表2

表3 快乐鼠尾草精油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白色念珠菌的抑菌直径

3.2 快乐鼠尾草精油的抑菌实验结果

抑菌直径敏感性判断标准：直径>20 mm属于极敏；20 mm≥直径>15 mm属于高敏；15 mm≥直径≥10 mm属于中敏；直径<10 mm属于低敏。

实验结果表示，快乐鼠尾草精油对于三种受试菌种都具有一定的抑菌效果。其中A厂家快乐鼠尾草对白色链球菌高敏，对大肠埃希菌中敏，金黄色葡萄球菌低敏，B厂家尾草对白色链球菌和大肠埃希菌高敏，对金黄色葡萄球菌极敏。三种精油中C快乐鼠尾草精油品牌的抑菌效果最佳，对三种受试菌均为极敏。其抑菌实验结果见图4和表4。

A1-1500.00 μg·mL-1克霉唑；A2-750.00 μg·mL-1克霉唑；A3-375.00 μg·mL-1克霉唑；A4- 187.50 μg·mL-1克霉唑；A5-9.375 μg·mL-1克霉唑。A6， B6， C6-氯化钠注射液(阴性对照)；A7，B7，C7-A快乐鼠尾草精油；A8，B8，C8-B快乐鼠尾草精油；A9，B9，C9- C快乐鼠尾草精油；B1，C1-1563 μg·mL-1氯霉素；B2，C2-781 μg·mL-1氯霉素；B3，C3-391 μg·mL-1氯霉素；B4，C4-195 μg·mL-1氯霉素；B5，C5-98 μg·mL-1氯霉素。

图4 快乐鼠尾精油的抑菌效果

3.3 快乐鼠尾草精油对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响

与空白对照组(152.28±27.2)比较，LPS模型对照组(715.46±88.62)细胞分泌TNF-α表达水平显著升高(P<0.01)；造模成功。与LPS模型对照组相比较，快乐鼠尾草精油各剂量(7.5 μg·mL-1、15 μg·mL-1、30 μg·mL-1)组细胞分泌TNF-α表达水平均显著降低(P<0.01)并具有一定的剂量依赖趋势。

图5 快乐鼠尾草精油对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响

4 结 论

通过气相色谱-质谱联用技术分析结果显示，三种快乐鼠尾草精油共分析鉴定出45种挥发性成分，仅有5种为其共有。三种厂家快乐鼠尾草精油均以萜烯类化合物为其主要成分，主要有d-柠檬烯，3-蒈烯和3-蒈烯。A厂家主要成分为d-柠檬烯(53.14%)、3-蒈烯(24.12%)，B厂家主要成分为d-柠檬烯(50.35%)、3-蒈烯(19.34%)；C厂家快乐鼠尾草精油主要成分为3-蒈烯(39.93%)、莰烯(13.07%)。三种厂家的主要挥发性成分于现有研究报道成分存在一定差异[9]；且C厂家和A，B厂家主要成分相差较大，这可能与各个厂家的工艺不同，检测方法的不同有关。在本实验已鉴定的这些成分中，很多化合物具有一定抗菌、抗炎活性。如d-柠檬烯和3-蒈烯。柠檬烯[10]和3-蒈烯[11]不仅能通过破坏细胞膜来发挥抑菌作用，其中铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为10 mL/L和 20 mL/L，还可以通过调控NF-κB，IκB 和TNF-α 的表达来抑制炎症[12]。

牛津杯法抑菌实验结果显示，三种厂家快乐鼠尾草精油均对受试菌种均有一定的抑制效果，对白色念珠菌的抑菌效果都为高敏(抑菌圈>15 mm)。相对而言，C厂家的抑菌效果最好，对三种菌种的抑菌圈均>200 mm。对金黄色葡萄球菌的抑菌效果甚至好于浓度为1563 μg·mL阳性药氯霉素的抑制效果。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-巨噬细胞产生的具有多种生物活性的多肽因子，主要功能为抗病毒感染、抑制和杀伤肿瘤细胞以及参与免疫调节，是参与炎性反应及引起组织细胞损害的主要介质[13]。本文通过检测LPS诱导RAW264.7验证模型中TNF-α的表达水平来评价快乐鼠尾草的抗炎效果，结果显示，快乐鼠尾草精油各剂量组TNF-α的表达均明显降低(p<0.05)。提示快乐鼠尾草精油可能通过降低TNF-α的表达来起到抗炎作用。

三种快乐鼠尾草精油结构复杂，各厂家之间成分相差较大。但均含有确切抑菌抗炎效果的3-蒈烯和d-柠檬烯。大量研究[14-16]证实了3-蒈烯和d-柠檬烯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，铜绿假单胞菌等的抑制作用。三种快乐鼠尾草精油抑菌效果差异原因未知，可能与3-蒈烯和d-柠檬烯含量的不同有关。王卉[17]等通过综述发现，植物精油在食品防腐抗菌方面的取得了良好的应用，且植物精油更加安全可靠。因此推测未来在食品防腐领域的开发可能是快乐鼠尾草的研究重点。