张园园 ， 张百慧 ， 李 简 , 刘书婷 ， 韩 莹 ， 王燕春 ， 蔡亚南

(吉林农业大学动物医学院 ， 吉林 长春 130118)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫感染引起的一类人兽共患的寄生虫病[1-2]。隐孢子虫病最常见的症状是腹泻，猪、羊、牛为该病病原体的主要宿主，动物感染后会表现出食欲减退、发热、腹泻腹痛、厌食消瘦、呕吐以及生长停滞等症状，最终导致生产性能下降甚至丧失，给畜牧业造成巨大经济损失[3-4]。

安氏隐孢子虫是引起奶牛胃肠道疾病的主要病原之一，患病奶牛常出现水样腹泻、脱水进而食欲减退、生产性能降低、产奶量下降，严重影响奶牛场的经济效益。目前，奶牛安氏隐孢子虫病尚无有效的疫苗和治疗药物。因此，建立快速、特异、敏感的奶牛安氏隐孢子虫的检测方法，明确奶牛场安氏隐孢子的流行特征尤为重要，可为安氏隐孢子虫病的防控提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂ExTaq酶为TaKaRa公司产品；粪便基因组DNA提取试剂盒为康为试剂生物科技有限公司产品。

1.2 样本 2018—2019年在河南、湖北和湖南的奶牛场共采集563份奶牛粪便，每份100 g，将其编号记录放入保鲜盒中带回实验室，4 ℃冰箱内保存。

1.3 卵囊的检测与收集 粪便先蒸馏水沉淀，后采用饱和蔗糖溶液漂浮法[5]，蘸取表面液膜，改良抗酸染色法染色镜检[6]。收集卵囊置于2.5%重铬酸钾溶液里保存，置于4 ℃冰箱备用。

1.4 DNA提取 按照试剂盒说明书提取卵囊的DNA，保存在-20 ℃冰箱备用。

1.5 引物设计与合成 在NCBI上的GenBank中下载安氏隐孢子虫18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列，通过DNAMAN进行比较获得保守区，通过Prime 5.0在保守区设计巢氏PCR引物，见表1。……