陈海全，李晓燕，马治欣

(平顶山市第二人民医院心胸外科，河南 平顶山 467000)

肺癌目前为全世界癌症死因的首位，约占所有恶性肿瘤的19%[1]，其中小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)占肺癌的15%～20%，属于恶性程度极高的神经内分泌肿瘤，老年人多发，男性多于女性[2]，具有对初始化疗敏感、转速增长、早期转移等特点[3]。有研究[4-5]报道，大多数SCLC患者发生转移后才被确诊，这时SCLC已处于广泛期，已错过最佳治疗时期，这也是SCLC的生存率较低的原因之一。因此SCLC的早期治疗尤其重要。近年来临床上对于SCLC的治疗很少采用手术方式，主要以化疗和放疗为主，虽然SCLC对化疗和放疗的敏感性高，早期初治改善症状效果显著，但预后较差。随着微创外科的快速发展，胸腔镜在肺癌治疗中的应用逐渐成熟起来[6]。但研究[7]发现，经胸腔镜肺癌根治后的患者出现复发转移的情况较多，肿瘤复发是影响患者预后的主要因素。巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)、趋化因子C-C-基元受体6(CCR6)与细胞的增殖、生长、迁移等有关，通过检测血清中的MIP-3α、CCR6水平变化可以预测肿瘤的复发和转移。本研究探讨SCLC患者MIP-3α、CCR6的表达在预测胸腔镜肺癌根治术后复发转移中的临床价值，报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年2月—2020年2月在平顶山市第二人民医院诊治的SCLC患者160例，根据术后是否发生复发转移分为转移组(n=70)和非转移组(n=90)。纳入标准：①临床TNM分期明确。②均采用胸腔镜肺癌根治术。③随访2 a。④临床资料完整者。⑤经临床、影像及手术病理确诊为SCLC。排除标准：①精神障碍，无法自主配合研究者。②合并其他恶性肿瘤者。③重要脏器功能严重障碍者。2组患者性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、肿瘤大小比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组患者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 检测方法 ①血清标本采集及检测方法：于SCLC患者手术前及手术后30 d采集2组患者的晨起空腹外周静脉血，静置20 min，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，用酶联免疫吸附法检测MIP-3α、CCR6水平。②SCLC组织MIP-3α、CCR6免疫组织化学染色：所有组织用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片脱蜡、水化、热修复；3%H2O2去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化酶，PBS冲洗2 min×3次；加入一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗2 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次；DAB显色，苏木精复染，常规脱水、树胶封固。PBS替代一抗作阴性对照。③实时荧光定量PCR检测：引物使用Primers软件，PCR热循环参数：90 ℃5 min；3步反应：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，于72 ℃ 30 s收集荧光信号。扩增完毕后，以GADPH为内参，得到MIP-3α、CCR6 mRNA表达量。④蛋白质印迹法检测：测定肺癌组织总蛋白水平，上样总蛋白总量为50 g，以3%SDS上样缓冲液定容于等体积，加入5×上样缓冲液，常温下SDS-PACE电泳，4 ℃电转至PVDF膜孵育相应一抗(1∶200)和二抗(1∶5 000)，然后化学发光，X线曝光、显影、定影。用Quantity One软件分析图片，以目的蛋白与内参吸光度比值进行半参量分析。

1.2.2 观察指标 ①2组患者血清MIP-3α、CCR6表达的部位。②2组患者MIP-3α、CCR6的表达情况：通过比较2组MIP-3α、CCR6阳性细胞率评分及染色强度评分来反映MIP-3α、CCR6的表达情况。阳性细胞率：0分：<25%；1分：26%～50%；2分：51%～75%；3分≥76%。阳性细胞率总评分=(0分患者例数×0)+(1分患者例数×1)+(2分患者例数×2)+(3分患者例数×3)。染色强度：阴性0分：不着色；弱阳性1分：淡黄色；阳性2分：棕黄色；强阳性3分：棕褐色。染色强度总评分=(阴性0分患者例数×0)+(弱阳性1分患者例数×1)+(阳性2分患者例数×2)+(强阳性3分患者例数×3)。③2组患者MIP-3α、CCR6高表达率和染色指数比较,高表达率定义为50%以上的细胞染色阳性。染色指数=染色强度平均值×阳性细胞率评分。分数在0～9分，每张切片随机计算5个40倍物镜视野中细胞表达阳性率及染色强度，求出染色指数，取平均值作为最终结果。④比较2组MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表达。

2 结果

2.1 MIP-3、CCR6在SCLC组织中的表达 MIP-3以免疫组化法染色，DAB显色，苏木精复染、封片，结果显示，其主要表达于细胞膜和细胞质中。CCR6以免疫组化法染色，DAB显色，苏木精复染、封片，主要表达于细胞质中。见图1-2。

2.2 2组MIP-3α、CCR6阳性细胞率评分及染色强度评分比较 转移组MIP-3α、CCR6阳性肿瘤细胞总评分分别为132分、122分，非转移组分别为为46分、45分；转移组的MIP-3α、CCR6的染色强度总评分分别为171分、172分，非转移组分别为121分、122分；转移组MIP-3α、CCR6表达高于非转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2-3。

图1 SCLC组织中MIP-3的表达情况(HE×100)

图2 SCLC组织中CCR6的表达情况(HE×100)

表2 2组MIP-3α、CCR6阳性细胞率评分比较

表3 2组MIP-3α、CCR6染色强度评分比较

2.3 2组MIP-3α、CCR6高表达率和染色指数比较 转移组MIP-3α、CCR6高表达率和染色指数高于非转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组MIP-3α、CCR6高表达率和染色指数比较

2.4 2组MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表达比较 转移组MIP-3α、CCR6mRNA和蛋白表达高于非转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 2组MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表达比较

3 讨论

肺癌的发病率和病死率均较高。据统计，2010年美国新增肺癌病例为222 000例，其中157 000例患者死亡[8]。肺癌分为SCLC与非小细胞肺癌(NSCLC)，两种类型的发病率、病理学类型、预后、生物学行为及对治疗的反应均存在较大差异[9]。其中，SCLC肿瘤细胞增加时间短、进展快，常伴有内分泌异常或类癌综合征，早期易转移，对放化疗敏感，预后较差[10]。腺癌表现为周围型实质肿块，早期可侵袭淋巴管、血管，常在原发癌引起症状前转移，易转移至脑、肝及骨，更易累及胸膜引发胸腔积液[11]。

生长因子构成趋化细胞因子家族，在人身体出现炎症时会导致全身白细胞的迁移，参与胚胎发育、血管生成、自身免疫及肿瘤细胞的生长和转移[12]。MIP-3受体是CCR6，靶细胞是未成熟树突状细胞和记忆细胞[13]。本研究发现，MIP-3主要表达于细胞膜和细胞质中，CCR6主要表达于细胞质中，与张霄鹏等[14]研究相似。既往研究[15]发现，恶性肿瘤细胞MIP-3、CCR6表达增加。有研究[16]发现，肝癌患者细胞表面的CCR6表达显著增加。赵海潮等[17]对小鼠肝癌MIP-3的研究发现，肿瘤组织由于趋化因子的缺失导致抗原提呈细胞不足，以引发肿瘤局部免疫反应而导致肝脏局部病变的侵袭及发展。GUO等[18]研究也显示，CCR6在恶性肿瘤患者中也会有高表达现象，CCR6的高表达与病毒的存活相关，与疾病复发风险相关，CCR6被认为是潜在的新的预后标志物。本研究发现，与非转移组比较，转移组MIP-3、CCR6表达显著增加，MIP-3、CCR6mRNA和蛋白表达显著升高，与上述研究结果一致。

综上所述，经胸腔镜肺癌根治术后复发转移的患者血清中MIP-3、CCR6的表达率较未复发转移患者高，且MIP-3、CCR6mRNA和蛋白的表达明显增加。MIP-3、CCR6表达与SCLC患者术后复发转移有一定关系。