侯 玥，崔 莉，于红霞，赵恒强，王 晓，王岱杰

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，济南250014；2.山东中医药大学中医学院，济南250014；3.威海金颐阳药业有限公司，威海264200)

病毒肺炎是临床常见的传染性呼吸道疾病。西医目前尚无针对病毒性肺炎的特效药，临床调查发现，病毒性肺炎的严重程度与病毒和机体炎症反应的强度相关，重症肺炎产生的原因是感染诱发了机体产生过度的免疫应答，因而对病毒性肺炎的免疫治疗显得尤为重要[1]。中医药在免疫调节、防治病毒性肺炎方面有明显的优势[2]，已报道多种特色中医方剂治疗病毒性肺炎的临床疗效[3]。但是中医理论指导预防病毒性肺炎的用药研究还较少。以中医理论为指导，从中药中寻找高效、安全的免疫调节剂对于病毒性肺炎的临床防治是一个重要的手段。

西洋参为五加科人参属重要的名贵中药，其药理作用已有了广泛报道，包括抗肿瘤和病毒、调节内分泌和免疫、中枢神经系统和心肌保护等[4]，其中免疫调节作用是其重要的功效，西洋参中皂苷、多糖等多种主要活性成分均具有较强的免疫调节作用，如西洋参总皂苷能刺激骨髓干细胞和脾细胞增殖活性，促进脾细胞产生白细胞介素-3和白细胞介素-6样物质，还能调控脾细胞中造血生长因子的产生，从而促进骨髓干细胞增殖[5]。西洋参在中药复方配伍中也发挥着提高免疫的作用[4]，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》推荐使用的中药复方中也有西洋参[6]，2020年1月国家卫健委将西洋参纳入按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点[7]，作为具有调节免疫功效的药食两用中药材，西洋参防治病毒性肺炎具有开发潜力和广阔前景。

网络药理学是运用系统生物学、高通量筛选等多种技术，从整体性与系统性的角度探析药物对机体疾病网络的干预与影响，通过构建“疾病-基因-靶标-药物”等关系网络，可有效预测药物功能，从而阐明中药多成分、多靶点、多通路的特征，是目前中药药效物质基础研究的重要手段之一。因而本研究发挥中医药整体调节的优势，基于网络药理学，探究西洋参预防病毒性肺炎的可能性及相关分子机制，以期为开发西洋参防治免疫疾病的系列功能产品提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 西洋参活性成分

基于中药系统药理数据库及分析平台TCMSP[8]及文献检索，筛选西洋参的主要入血活性成分。根据TCMSP平台推荐的参数，设置筛选条件为：口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18。

1.2 预测目标靶点

TCMSP及文献中检索的入血活性成分用Pub-Chem[9]确定结构，并下载smiles标准结构式。将smiles标准结构式输入SwissTargetPrediction[10]工具预测化合物靶点集合，选择Probability＞0.02的靶点，将结果导入Cytoscape3.7.1并分析数据，绘制西洋参-化合物-靶点网络图。用GeneCard[11]数据库检索病毒性肺炎的相关靶点，以“Viral pneumonia”、“pneumonia”、“cytokine release syndrome”[1]为关键词，收集病毒性肺炎的靶点集合；取西洋参化合物和病毒性肺炎两集合的靶点交集作为目标靶点。

1.3 PPI蛋白互作网络分析

目标靶点输入STRING[12]工具用以构建目标靶点蛋白互作PPI网络，将结果导入Cytoscape3.7.1绘制PPI网络图。利用Cytoscape3.7.1插件CytoHubba筛选重点靶点。CytoHubba提供了11种拓扑分析方法，包括Degree（度值），EPC（边过滤成分），MNC（最大邻域分量）等基于最短路径的计算方法；本研究依据给定的重要性概念和网络中心性对节点进行排名，选取MCC（最大集团中心性）分析方法，重点靶点数设为Top20。

1.4 GO和KEGG富集分析

将目标靶点列表导入DAVIDE[13]工具，选择基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和遗传关联数据库（GAD）分别进行通路和疾病的富集分析，基因本体论（GO）富集分析包括分子功能（MF），生物过程（BP）和细胞成分（CC）三类条目。结果用Excle和Cytoscape3.7.1展示。

2 结果和分析

2.1 西洋参的活性成分

按照1.1的筛选条件，共筛选出西洋参的主要入血活性成分14个，其中8个基于TCMSP平台得到。文献检索得到西洋参主要活性成分为：人参皂苷Rb1、Rg1和Re[14]，根据人体的代谢动力学，人参皂苷Rb1降解迅速，人参皂苷Rd、Rg3、Rh2等中间产物及代谢终产物20（s）-原人参二醇是24h后仍可以检测到的入血成分[15]。人参皂苷Re的最终入血成分有人参皂苷Re、Rg1和人参三醇[16-17]。因此，人参皂苷Rd、Rg3、20（s）-原人参二醇、Re、Rg1和人参三醇虽然没有达到TCMSP的筛选条件，但作为西洋参的主要成分和代表性入血活性成分，也纳入研究。综上所述，通过TCMSP平台获得8个活性化合物，文献检索获得6个活性化合物，共获得西洋参活性化合物14个，详见表1。

表1 西洋参的活性成分Table 1 Active ingredients of AG

2.2 西洋参的靶点分析

通过SwissTargetPrediction工具预测西洋参活性成分的靶点313个，绘制西洋参-化合物-靶点网络图见图1，图中圆圈节点代表化合物预测的靶点，V节点代表化合物，8边形节点代表西洋参，节点越大代表度值越大即与该靶点相连的化合物越多。从图1可见基于不同化合物共同的靶点，西洋参的化合物成分具有明显的分群，14个化合物被分成4组。每组中呈圈状排列的靶点是圈内化合物的共同靶点，每组中矩状排列的靶点为该组内某一个或某两个化合物单独或重合的靶点，组间共同靶点位于中央呈矩状排列。组①中的聚乙炔类挥发性成分PQ-2和PQ-2和人参三醇的靶点重合较多，组②的甾醇类化合物（7-去氢豆甾醇、β-谷甾醇1和β-谷甾醇2）和20（s）-原人参二醇的靶点重合较多，组④的人参皂苷Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1和F2，这六个皂苷类化合物的靶点重合较多。化合物分群的原因可能是结构相似的化合物拥有相同的官能团。

其中人参皂苷类化合物是西洋参的主要成分，因此皂苷类化合物的靶点代表了西洋参的主要药理作用。皂苷类化合物的共同靶点包括RORC（人类核受体ROR-γ）、IL2（白细胞介素2）、PSENEN（早衰蛋白增强子2）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、LGALS3（重组人半乳糖凝集素3）、FGF1（成纤维细胞生长因子1）、APH1A（前咽部缺陷1同源物A）、LGALS8（重组人半乳糖蛋白8）、PSEN2（早衰蛋白2）、STAT3（信号传导及转录激活蛋白3）、NCSTN（呆蛋白）、HPSE（乙酰肝素酶）、ATP1A1（钠钾ATP酶α1肽）、FGF2（成纤维细胞生长因子2）、PTAFR（血小板活化因子受体）、APH1B（前咽部缺陷1同源物B）、LGALS4（人半乳糖凝集素4）、PSEN1（早老素1）、BCL2L1（B淋巴细胞瘤-2）、HSP90AA1（90KDA热休克蛋白AA1）。

RORC、IL2、STAT3是参与免疫调节的主要分子。RORC的重要作用表现在调节Th17极化和功能以及胸腺细胞发育[18]，IL2是是T细胞代谢程序的关键调节器，通过控制关键细胞因子受体、转录因子、染色质调节剂和效应细胞因子的表达来控制CD4+T细胞的分化和功能[19]。STAT3在控制免疫中起关键信号传递作用，可以调节先天免疫反应和适应性免疫，诱导IL-17产生（Th17）细胞。此外，还能调控巨噬细胞中的抗炎信号传导[20]。另外FGF-1有辅助免疫的协同增效功能，FGF-1和抗CD3共刺激T细胞后产生IL-2明显高于单独使用CD3刺激T细胞[21]。西洋参主要成分人参皂苷类化合物的主要靶点中有调节免疫和炎症关键过程的相关分子，证明西洋参在提高免疫方面的价值。

图1 西洋参-化合物-靶点网络图Fig.1 AG-compound-target network

图2 西洋参-④组成分-共同靶点-通路-疾病网络图Fig.2 AG-④components-common target-pathway-disease network diagram

本研究将西洋参皂苷（组④成分）的靶点进行了疾病富集分析，预测分析西洋参治疗疾病的潜力。“西洋参-组④成分-共同靶点-通路-疾病”网络见图2，结果发现西洋参在治疗自身免疫性疾病方面具有潜力，包括多发性硬化、银屑病关节炎、糖尿病，同时西洋参对于治疗人体免疫相关其余疾病也有潜力，如胃肿瘤，霍奇金病，白血病。因此，从调控免疫的潜力方面分析，西洋参防治病毒性肺炎有一定可行性，同时西洋参对炎症和癌症相关通路，以及阿尔兹海默病的治疗潜力，有待于进一步研究。

2.3 目标靶点及PPI网络

GeneCard数据库收集病毒性肺炎的相关靶点共1265个，将西洋参的313个靶点与之进行映射，得到共同靶点120个，绘制韦恩图见图3。这120个靶点即为西洋参防治病毒性肺炎的目标靶点，目标靶点占西洋参靶点的39%，因而日常服用西洋参提高免疫力对预防病毒性肺炎有一定意义。

将120个目标靶点输入STRING工具，构建目标靶点的蛋白质互作PPI网络图见图4，共有120个节点，1440条边，节点越大，颜色越冷代表度值（Degree）越大；边越粗，颜色越冷代表结合分数（combinedscore）越高。将PPI网络导入Cytoscape3.7.1并用CytoHubba插件筛选重点靶点见图5，节点越大代表度值越大，节点越红代表MCC算法后的分值越高。重要的靶点有STAT3（信号传导及转录激活蛋白3）、MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶3）、EGFR（表皮生长因子受体）、MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、BCL2L1（B细胞淋巴瘤2）、CASP3（胱天蛋白酶3）、MTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）、MAPK8（丝裂原活化蛋白激酶8）、ESR1（雌激素受体1）、PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶）、IGF1R（胰岛素样生长因子1受体）、TNF（肿瘤坏死因子）、AKT1（丝氨酸苏氨酸蛋白激酶）、AR（醛糖还原酶）、HSP90AA1（90KDA热休克蛋白AA1）、MAPK14（丝裂原活化蛋白激酶14）、FGF2（成纤维细胞生长因子2）、MAP2K1（促分裂原活化蛋白激酶激酶1）、HIF1A（缺氧诱导因子-1）。

本研究检索了病毒性肺炎相关的疾病基因，发现西洋参与之重合的基因与免疫相关。CytoHubba筛选的重点靶 点 中STAT3、MAPKs（MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAP2K1、MAPK14）、VEGFA、HIF1A、MTOR均与病毒感染有关。如STAT3信号传导可以维持病毒感染，刺激病毒基因表达，抑制干扰素的抗病毒作用，促进多种肝炎病毒的疾病进程[22-26]。MAPKs家族是一类有应激适应、炎症反应等重要功能的调控因子[27]。VEGF表达的上调使多种病毒受益。HIF-1α、COX-2、AP1、IL6/MTOR多种通路上调VEGF表达，使卡波西氏肉瘤疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒和登革热病毒等受益于其自身发病机理的生理功能[28]。综上，从抗病毒感染靶点方面的相关性分析，西洋参防治病毒性肺炎具有可能性。

图3 西洋参和病毒性肺炎映射靶点Fig.3 AG and病毒性肺炎mapping targets（蓝色为病毒性肺炎相关靶点，红色为西洋参靶点）

图4 目标靶点的PPI网络图Fig.4 PPI network diagram of the target

图5 CytoHubba筛选重点靶点Fig.5 CytoHubba screening key targets

2.4 GO和KEGG富集分析

目标靶点的基因本体论（GO）富集分析见图6，结果显示生物过程主要包括蛋白质改变以及炎症反应，细胞成分主要涉及质膜和细胞表面，分子功能主要有激酶活性和蛋白质结合。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析见图7，KEGG富集分析显示的条目主要有病毒感染相关的通路如：乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感、EB病毒感染、麻疹和HTLV-I感染；炎症相关通路如：HIF-1信号通路、FcεRI信号通路、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路和MAPK信号通路；免疫相关通路如：T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性；以及癌症相关的通路如：癌症的途径、胰腺癌和Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路等；富集分析的结果提示了西洋参可能通过影响抗病毒感染、抗炎和调节免疫等通路发挥防治病毒性肺炎的作用。将2.2中的重点靶点进行KEGG富集分析，得到西洋参-化合物-重点靶点-通路见图8，图7与图8通路对比如表2（见附页）所示，可见重点靶点基本代表了西洋参治疗病毒性肺炎的主要药理作用，集中在抗炎和抗病毒感染，同时发现西洋参有良好的抗癌潜力。

图6 GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis

图7 KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis

图8 西洋参-化合物-重点靶点-通路Fig.8 AG-Compound-Target-Pathway

近年来，西洋参提高免疫抗病毒的药理作用及其分子机制的相关研究已有较多报道。Cesare等[29]的临床研究表明西洋参提取物可能通过提高人体免疫改善上呼吸道感染，常规服用西洋参提取物的老年人尤其是高危老年人感冒时症状较轻，且痊愈周期时间变短。Liou等[30-31]发现西洋参（5500μg/mL）能刺激B淋巴细胞增殖，并增加小鼠脾细胞中白细胞介素（IL）-2、IL-10和干扰素-γ的产生。Miller等[32]报道西洋参可以增加小鼠脾脏和骨髓中的自然杀伤细胞数量。

研究显示人参皂苷Rg3可预防新生小鼠轮状病毒感染[33]，还可通过TNF受体相关因子6/转化生长因子β活化激酶1的降解和c-Jun N端激酶/AP-1信号的抑制而表现出抗乙型肝炎病毒活性[34]，Rg3可通过降低p21来抑制丙型病毒肝炎的增殖[35]。Lee等[36]发现人参皂苷处理的FRhK-4细胞甲型肝炎病毒的感染降低。Jeong[37]等证明人参皂苷Rh1可能通过抑制PDK1/Akt途径消除HIV-1感染的细胞保护性巨噬细胞。人参皂苷Rg1增强Th1（IgG2b和IFN-γ）和Th2（IgG1和IL-4）的响应，提高免疫应答对抗乙型肝炎病毒[38]，Rg1通过降低促炎细胞因子（包括IL-1β，IL-8，IL-6和TNF-α）的mRNA水平和抑制病毒感染触发的NF-κB信号通路[39]，发挥抗2型猪繁殖与呼吸综合征病毒活性。人参皂苷Rb1或Rg1预处理可以诱导猫杯状病毒感染的CRFK细胞抗病毒蛋白IFN-α，IFN-β，IFN-ω的表达，降低病毒滴度[40]。可见人参皂苷类成分能通过阻断病毒感染、抑制病毒代谢过程和免疫调节等多途径发挥其广谱抗病毒效果。

同时富集的结果发现西洋参可能通过免疫及癌症等途径预防病毒引起的肺炎。起源于20世纪初的病毒致癌学说[41]就提出了病毒感染和癌症的相关性，最近的研究也发现了病毒致癌的证据，代谢重编程可能是病毒致癌的机制[42]，病毒进入宿主细胞有相似的代谢改变。西洋参抗癌作用有广泛的报道，西洋参的皂苷可以对抗乳腺癌[43]、肺癌[44]、大肠癌[45]、前列腺癌[46]等多种癌症。病毒感染人体后的代谢变化与肿瘤相似，因而也可以推测用西洋参调节人体代谢环境，营造不利于病毒复制生存的环境可能有助于预防病毒性肺炎，这与中医理论“正气存内，邪不可干”有极高的相似性，这将是未来研究的重要方向。

3 结论

本研究基于网络药理学筛选出西洋参的主要入血活性成分14个，其中8个为人参皂苷类化合物，人参皂苷的靶点重合度很高，其主要靶点的药理作用基本代表了西洋参的药理作用，分析得到其药理学作用包括提高免疫、抗炎、抗癌、调节内分泌和调节中枢神经系统等。西洋参全部靶点的39%与病毒性肺炎相关，富集分析的条目包括病毒感染相关途径、免疫和炎症相关的通路、癌症相关的通路。癌症和病毒感染激活的生物合成途径相似，西洋参在人体的作用机制以抑制肿瘤为主，可以调节人体的代谢环境向不利于肿瘤发生发展的方向前进，这种环境同样也不利于病毒复制。因此，西洋参在抗病毒感染、抗炎和调节免疫方面具有防治病毒性肺炎的潜力。