徐怡朦 唐 靓 王 晗 杨亚冬 赵思雨 张文元

1 杭州医学院生物工程研究所，浙江省杭州市 310013； 2 杭州医学院保健食品研究所； 3 杭州医学院卫生学研究所

导致肝癌预后较差的一个重要原因就是肝癌细胞易产生耐药性[1]。当前临床经验采用手术以及放疗和化疗的方式进行治疗，虽然对抑制肝癌细胞的增生起到了一定的效果，但往往同时对患者的身体产生较大的毒副作用，甚至对正常细胞产生一定的杀伤力[2]。在这种背景下，中医或中西医结合抗癌研究非常活跃。中药抗癌作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，同时毒副作用相对较低，能提高机体免疫力，不易产生耐药性[3]。中医药治疗或中西医结合治疗肝癌被越来越多的患者所接受，中医药治疗重视全身的整体治疗，对患者产生的副作用小，利于改善患者的生命质量。随着临床经验的不断丰富，中药治疗肝癌的方式逐步得到临床的认可，在肝癌的治疗中发挥了重要作用[4-5]。

白术[6-7]和薏米[8-9]作为传统中药被广泛使用，它们的主要化学成分有挥发油、多糖、内酯类等，具有抗肿瘤、抗炎、调节消化系统等药理作用。临床常应用于胃肠道疾病、心血管疾病、免疫系统疾病、肝脏疾病等治疗。肝癌是我国常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、进展快的特点。3D生物打印作为新型高通量药筛平台已经成为临床前药物筛选的新的选择方向。3D细胞培养相对于2D平面培养，药物反应、抗药性程度以及药物渗透水平等各方面更接近于体内真实情况[10]，更能准确反映人体用药反应[11]。本研究采用3D生物打印技术构建SMMC-7721细胞 3D水凝胶类肝癌模型，并进行白术和薏米两种中药醇提液的药敏试验，为临床上肝癌中医治疗提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞购自上海中科院细胞库。白术和薏米(图1)购自安徽省亳州市网上药店药掌柜，符合2015年版《中华人民共和国药典》。低糖DMEM培养基(Gibco，Lot:8119261)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，批号：T4049)，海藻酸钠(Sigma-Aldrich,Lot#SLBD5697v)，明胶(Sigma-Aldrich,Lot#SLBB0914v)，无水CaCl2(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司,Lot.No.20150507)，钙黄绿素-AM(calcein-AM，CAM，Solarbio，LotNO405A)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，Solarbio, LotN1025A)。3D生物打印机(BioScaffolder2.1，GESIM公司，德国)，CO2培养箱(HEPA Class100，Thermo)，荧光倒置显微镜(IX73，Olympus，日本)，3111型CO2培养箱(Thermo)，酶标仪(Thermo公司)。96孔培养板(Corning)，25cm2培养瓶(Corning)。

白术 薏米图1 白术和薏米

1.2 中药醇提方法 白术和薏米提取物由下述步骤提取。称取生药30g，用去离子水清洗1遍，加40℃的去离子水1 000ml浸泡0.5h。将其全部置于砂锅内煎，将粗制的水煎液倒入烧杯，放于恒温磁力搅拌器上80℃加热浓缩药液至50ml，静置至室温后封口于4℃沉淀过夜。之后收集上清液用于进一步提取。待冷却至室温后边搅拌边缓慢加入适量95%乙醇溶液，使乙醇终浓度达到80%，4℃冰箱静置过夜。1 000g离心10min分离沉淀和上清。上清收集后上80℃加热，使乙醇充分蒸发，最后得醇提的浓缩液5ml，生药含量为2.4g/ml。将分离得到的上清用0.22μm滤膜抽滤除菌后置于玻璃瓶内，4℃保存。

1.3 中药醇提液对2D肝癌细胞培养的增殖抑制率及细胞存活率 SMMC-7721细胞长到80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。取对数生长期的SMMC-7721细胞悬液，通过台盼兰染色、计数，确认细胞存活率>90%。取SMMC-7721细胞悬液以1×105cells/ml浓度接种96孔板，每孔100μl，培养24h；弃上清，分别加入2种中药提取物配制的6种浓度的药液(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)，200μl/孔，每个浓度设3个复孔，显微镜观察细胞形态变化，并拍照记录；48h后，吸弃上清，每孔加入500μg/ml MTT 100μl，37℃静置避光培养4h，弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜；室温振荡10min使沉淀结晶完全溶解，酶标仪490nm波长检测每孔的吸光度OD值。根据吸光度计算不同时间不同浓度的中药对细胞的增殖抑制率，增殖抑制率IR(%)=(无药物对照组OD值-药物处理组OD值)/(无药物对照组OD值-空白组OD值)×100%。细胞存活率CSR(%)=(1-增殖抑制率)×100%。

1.4 3D生物打印技术构建肝癌模型 SMMC-7721细胞水溶胶共混物的制备：1.5g海藻酸钠干粉、0.5g明胶干粉加于20ml生理盐水中，低速搅拌混匀，形成水溶胶。每天70℃、30min水浴间歇灭菌，连续3d。然后将灭菌后的水溶胶与SMMC-7721细胞悬液5∶1混合，轻柔混匀，经300g离心3min，使气泡消失。得到细胞密度为2×107cells/ml的SMMC-7721细胞水溶胶共混物(简称7721细胞共混物)。

3D生物打印是基于微流连续挤出的生物绘图技术，进行结构体的CAD建模与控制参数。拟构建内部结构为网格状的结构体，尺寸大小为8mm×8mm×0.5mm，该网状结构体由圆柱状微丝逐层交错堆积形成，微丝交错构成的孔隙大小设定为200μm×200μm。3D生物打印成形过程的主要控制参数:成形温度8℃，打印喷头内径为0.15mm，打印速率为15mm/s，挤出压力200kPa，上升层高为0.15mm，料桶温度37℃，与打印喷头相连。

进行3D生物打印肝癌7721细胞结构体：将7721细胞共混物置于3D生物打印机的料桶中，按照预先设定的CAD数字模型及成形参数，由空气气压推动柱塞水溶胶挤出成形。将7721细胞共混物挤出圆柱状微丝，逐层交错堆积于无菌6孔培养板中，形成三维网状结构体。挤出的共混物因明胶的温度敏感性发生物理交联，由溶胶转变为凝胶。打印后立即用5%CaCl2溶液交联5min，海藻酸钠转变为海藻酸钙凝胶，使支架结构得以稳固，低糖-DMEM培养基漂洗3次。获得半透明网格状带气孔的、有较高孔隙率的肝癌7721细胞—海藻酸钠—明胶三维结构体，即肝癌模型。

1.5 中药对3D肝癌模型中肝癌细胞增殖力的作用 将打印好的细胞结构体(肝癌模型)置于96孔板，用完全培养基(含10%FBS)200μl/孔培养，隔天换液。实验组：肝癌模型中的肝癌细胞培养5d后去除废液，PBS清洗,取不同浓度(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)的醇提中药，200μl/孔培养，每组设3个复孔。加药后再培养48h，除去废液，PBS清洗，作为实验组。而对照组不加药液，于培养7d后除去废液，PBS清洗。进行如下活/死细胞染色并计算细胞存活率。

活/死细胞染色：根据制造商说明书，荧光活/死染色法用于确定充满细胞的3D结构中的细胞活力。将上述SMMC-7721细胞结构体在PBS中轻轻清洗3次，然后浸入染色液中。以PBS配置1μM calcein-AM和2μM PI染色液，对活细胞(绿色)和死细胞(红色)进行30min的避光染色。采用荧光倒置显微镜分别在488nm(calcein-AM的激发波长)和543nm(PI的激发波长)处进行图像采集，并合并这2个激发波长的图像。每种样品随机抽取三个视野。细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism8统计软件包进行分析,使用非线性回归和方差分析，组间两两比较，实验数据用mean±SD表示，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 SMMC-7721细胞2D与3D形态对比观察 生长在2D平板上的SMMC-7721细胞保持单层，呈现扁平形态，与平板紧密贴壁(图2)。3D打印的7721细胞—海藻酸钠—明胶3D结构体，为半透明网状高孔隙度3D结构(图3)。

图2 光镜下2D平面生长的SMMC-7721细胞(×100，标尺=100μm)

图3 刚打印的3D结构体支架

倒置显微镜观察新打印的3D结构体SMMC-7721细胞(0h)，细胞呈球形，表面光滑，均匀分布于水凝胶中(气孔除外)。打印48h后，细胞仍为光滑的球形，靠近孔的细胞因营养丰富而迅速增殖为多细胞簇。箭头表示细胞之间紧密相连。打印96h后，观察到孔附近的细胞已增殖为束状多细胞簇。箭头表示束状多细胞簇(图4)。

图4 培养0h、48h、96h的3D SMMC-7721细胞(×100，标尺=100μm)

2.2 2D培养条件下中药对SMMC-7721细胞增殖的抑制率 为了找到SMMC-7721的最佳TCM及其最佳浓度，本实验测试了白术、薏米醇提液对2D环境中细胞的抑制作用。在2D培养条件下，SMMC-7721细胞对不同中药及其不同浓度的敏感性存在显著差异，白术提取物对肝细胞癌有更好的效果。薏米提取物在低浓度时(0.096、0.12g/ml)，促进了SMMC-7721细胞生长。随着提取物浓度的增加，白术和薏米提取物对肝癌细胞的抑制率增加(图5)。

图5 2D培养条件下白术和薏米提取物对SMMC-7721细胞生长的抑制率

2.3 3D培养条件下中药对SMMC-7721细胞存活的影响 3D培养的SMMC-7721细胞分别用白术、薏米醇提液处理48h后，通过双荧光活/死染色发现：当白术浓度为1.2g/ml和0.48g/ml时，没有SMMC-7721细胞存活，死细胞边缘不规则，部分细胞已经碎片化。在浓度为0.24g/ml和0.16g/ml时，发现少量活细胞，但细胞起皱。在浓度为0.12g/ml和0.096g/ml时，活细胞数量略有增加，但大量活细胞仍处于萎缩状态(图6)。

当薏米浓度为1.2g/ml时，SMMC-7721活细胞比例高于其他低浓度组，甚至高于空白对照组，而其他低浓度组无显著差异。薏米高浓度会增加细胞的存活率。这与2D中发生的情况相反(图6)。

通过图6合成图7。在3D培养条件下，白术醇提液的药效明显强于薏米。药物浓度与细胞抑制率呈显著的线性关系。薏米醇提液的作用较弱，且浓度与细胞抑制率之间没有显著的线性关系(图7)。

图6 3D培养条件下白术和薏米提取物对SMMC-7721细胞存活的影响(×100倍)

根据细胞存活率=(1-增殖抑制率)×100%，将图5与图7合并为图8。白术提取物在2D和3D培养条件下都对SMMC-7721细胞具有良好的杀伤作用，两者间差异不显著，并且药物浓度与细胞抑制率呈显著线性关系。而薏米提取物对SMMC-7721细胞杀伤效果差，其浓度与细胞抑制率无明显线性关系。使用非线性回归得出IC50值：白术在2D条件下IC50值为0.114 7g/ml，3D条件下为0.074 2g/ml；薏米在2D条件下IC50值为0.160 8g/ml，3D条件下无IC50值；方差分析进行二种中药的2D与3D存活率比较，P值均<0.000 1。

图7 3D培养条件下SMMC-7721细胞在白术和薏米提取物作用下的存活率

在3D培养条件下，白术醇提液的药效明显强于薏米。药物浓度与细胞抑制率呈显著线性关系。薏米醇提液的作用较弱，且浓度与细胞抑制率之间没有显著的线性关系(图8)。

图8 白术和薏米提取物在2D和3D条件下分别对SMMC-7721细胞作用的存活率*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 ****P<0.000 1

3 讨论

当前临床经验采用手术以及放疗和化疗的方式进行肝癌的治疗，化疗在综合治疗中占有重要的地位，虽然对抑制肝癌细胞的增生起到了一定的效果，但往往同时对患者的身体产生较大的毒副作用，人体对化疗药物的个体差异性也大，当临床确定患者对应用的药物不敏感时，患者已经承受了极大的痛苦及严重的不良反应，甚至杀伤了正常细胞[12-13]。在这种背景下，医学专家把希望寄托在中药抗癌研究上，寻求中医或中西医结合治疗，中医药领域抗癌的研究异常活跃。中药可以通过诱导肝癌细胞凋亡[14]、细胞周期阻滞和迁移抑制等方式，对肝癌的治疗产生明显的作用[15]。同时，由于中药性质比较温和，对患者身体的损伤较小，中药或与放化疗相配合，可以提高患者生存质量、改善体质、缓解临床症状、减轻放化疗副作用[16-17]，可在今后临床治疗肝癌中推广应用，中西医结合治疗已经成为重要的治疗手段[18-19]。利用中药活性成分研发新药是我国药物研究的特色和捷径，寻找有效的中药对改善肝癌患者预后具有极其重要的意义[20-21]。

肿瘤细胞的耐药现象是影响化疗疗效和患者预后的重要因素之一[22]，导致肝癌预后较差的一个重要原因就是肝癌细胞易产生耐药性。建立适合的体外耐药模型是耐药研究的关键。经验性化疗存在一定盲目性，而通过检测肿瘤对化疗药物的敏感度，可合理联合用药，以“个体化”化疗取代盲目性化疗。

三维(3D)生物打印技术可将细胞与材料一起混合打印，细胞可深入基质材料内部，实现细胞3D定位与控制，构建更接近体内癌细胞病变的3D肿瘤模型[11,23]，促进抗癌药物的筛选。3D培养组织细胞对外界,尤其是对药物的抵抗力增强，可更准确地反映候选药物的效果[24]。海藻酸钠和明胶基本满足支架3D打印材料的要求。海藻酸钠是从天然褐藻中提取的多糖，与细胞外基质中的糖胺聚糖相似，具有良好的水溶性和生物相容性。海藻酸钠可与钙离子快速结合，在原位形成稳定的凝胶[24]，细胞损伤小。其凝胶状的网状结构提供了足够的附着表面，使肝癌细胞在更接近生理的环境中生长，这有助于细胞保持活性并分泌大量基质。明胶是一种对温度敏感的天然高分子材料，具有良好的生物相容性和生物降解性[25]。

已有研究表明，白术和薏米具有广泛的抗肿瘤药理活性，能协同化疗药物的治疗，常作为抗肿瘤中药使用。在本实验中，白术醇提液无论是在2D还是3D条件下对7721细胞的杀伤力效果都很好，但是在3D条件下，醇提液的药效减弱幅度较大。2D与3D差异显著，总体原因可能是由于水凝胶和3D细胞状态引起的细胞表达的分子差异，以及细胞微环境的变化，导致2D培养细胞和3D培养细胞之间显著不同的药物作用结果。与2D和3D细胞培养相比，3D打印的SMMC-7721水凝胶结构的耐化学性明显增强。结果表明，维度对化疗的有效性起着重要的作用。