王 斌，梁伟龙*，林钦贤，康志英，王其丰，郝建新，刘庆丰

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.亳州市沪谯药业有限公司，安徽 亳州 236800；3.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300；4.四川香雪制药有限公司，四川 南充 637000)

香附为莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效[1]。香附含有挥发油类、黄酮类、糖类、生物碱、酚类、三萜类等化学成分[2]，其中α-香附酮能显著抑制大鼠离体子宫肌收缩，为香附调经止痛的主要药效成分[3]，香附乙酸乙酯提取物和水醇提取物亦有较强的药理活性[4]。现代药理学研究表明，香附可作用于中枢神经系统、心血管系统、消化系统，并具有雌激素样作用和抗菌消炎作用[5]，中医临床应用广泛。

目前关于香附的炮制研究以醋炙香附[6-7]、醋煮香附[8]、醋蒸香附[9]、四制香附[10]较多，酒香附的炮制研究较少。香附生品多入解表剂中，以理气解郁为主，酒炙后能通经脉、散结滞[11]，临床上常用于治疗疝气胀痛及小肠气，疗效确切，在山东[12]、湖南[13]、河南[14]、陕西[15]等地方炮制规范中均有收载。传统的酒炙法是加黄酒闷润后在锅中炒干，炒制的火力、时间等全凭操作工的炮制经验，具体炮制工艺参数难以量化。本研究以正交试验设计烘烤法代替传统的酒炙法，以α-香附酮、总黄酮、浸出物的含量为考察指标，利用综合加权评分法对酒香附的炮制工艺进行优选，旨在实现酒香附生产工艺参数的量化。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RHP-100型高速多功能粉碎机(浙江永康市荣浩工贸有限公司)；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱、HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；TC-15型电热套(海宁市新华医疗器械厂)；XS-204型、MS-603S型电子天平(Mettler Toledo)；KQ-500DA型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；EYELA型旋转蒸发仪(上海爱朗股份有限公司)；国标检验筛(新乡市富皓机械设备有限公司)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪(赛默飞)。

1.2 材料

α-香附酮(110748-201815，中国食品药品检定研究院，纯度99.7%)；芦丁(100080-201811，中国食品药品检定研究院，纯度92.4%)；绍兴黄酒(20181212，浙江圣塔绍兴酒有限公司)；乙醇、甲醇、石油醚等均为分析纯，实验用水为超纯水；香附药材购于山东，经广州市香雪制药股份有限公司康志英制药高级工程师鉴定为莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 浸出物含量测定

按照《中国药典》2015年版(通则2201)醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，以稀乙醇作溶剂。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg对照品的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取香附粗粉约2 g，精密称定，加70%乙醇30 mL，加热回流2 h，放冷，滤过，残渣再加70%乙醇25 mL，加热回流2次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，用石油醚(30～60 ℃)振摇提取4次，每次40 mL，合并石油醚液，用乙酸乙酯充分洗涤4次，每次40 mL，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加70%乙醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 最大吸收波长选择 取对照品溶液、供试品溶液各2 mL，分别加入5%硝酸钠溶液0.5 mL，10%硝酸铝溶液0.5 mL，以相应的试剂为空白，在200～800 nm全波长下进行扫描，结果显示对照品与供试品均在507 nm处有最大吸收，因此选择507 nm为检测波长。

2.2.4 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠0.3 mL、4%氢氧化钠4 mL，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。以相应的试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，于507 nm波长处分别测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为A=1.141C-0.025 1，r=0.999 6，表明芦丁在0.009 2～0.069 mg·mL-1浓度范围内与峰面积积分呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度考察 取芦丁对照品溶液2 mL，按照“2.2.1”项下方法制备对照品溶液后连续测定6次，结果芦丁吸光度RSD为0.69%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一批香附粉末2 g，按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定芦丁含量。结果6份供试品溶液中芦丁平均含量为1.01%，RSD为0.88%，表明该方法的重复性良好。

2.2.7 稳定性考察 按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、10、20、30、45 min后测定吸光度，计算其RSD为1.65%，表明供试品溶液在45 min内基本稳定。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的香附粉末6份，每份1 g，分别加入芦丁对照品3.0 mg，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度。结果6份样品中总黄酮平均加样回收率为99.2%，RSD为1.4%，符合规定。

2.3 α-香附酮含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水(72∶28)，柱温：25 ℃，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：254 nm，进样量：10 μL，理论塔板数按α-香附酮峰计算应不低于4 000。在此条件下分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样分析，HPLC色谱见图1。

A：对照品；B：供试品；C：空白

2.3.2 对照品溶液制备 取α-香附酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg对照品的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 取香附粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇80 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 分别精密吸取α-香附酮对照品溶液1、3、5、7、10、15 μL注入色谱仪中进行分析。以α-香附酮对照品含量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得到回归方程：Y=15.137X+0.592，r=0.999 6，表明α-香附酮在0.051～0.640 μg进样量范围内与峰面积积分呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度考察 精密吸取α-香附酮对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，结果峰面积RSD为0.88%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性考察 按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、12 h后精密吸取10 μL进样分析，测定峰面积，结果峰面积RSD为0.94%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.7 重复性考察 按照“2.3.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.3.1”项色谱条件下进样分析，测定峰面积。结果峰面积RSD为0.62%，表明该方法的重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的香附粉末1 g，共6份，分别精密加入对照品溶液100 μL，按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进行分析，测定结果。结果平均加样回收率为99.2%，RSD为1.69%，符合规定。

2.4 正交试验方案设计

查阅相关文献，本次试验选择黄酒量、浸润时间、香附粒度和烘烤温度为考察因素，按L9(34)正交试验表进行设计，每个实验条件重复3次，因素水平设计见表1。本次试验以各炮制品中α-香附酮、总黄酮、浸出物的含量为指标，利用综合加权评分法确定最佳的炮制方法。具体权重：α-香附酮为香附调经止痛功效的主要药效成分，权重占40%；浸出物为酒香附地方炮制规范中规定测定的项目，权重占40%；总黄酮含量权重占20%。打分方法为α-香附酮含量越高越好，故以含量最高的样品为100分，如7号样品为100分，则1号样品得分为0.132 6/0.134 3×100=98.73分，浸出物、总黄酮得分计算方法与α-香附酮相同，各项试验指标按照权重相加得分即为综合得分。正交试验安排及结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 炮制工艺因素水平

表2 正交试验安排及结果

表3 方差分析结果

由方差分析结果可以看出，因素C、D对实验结果具有显著性影响(P<0.05)，A、B对实验结果影响不显著(P>0.05)。由极值R可知，各因素作用的主次顺序为D>C>B>A。按照综合加权评分值越大越好的原则，最佳组合为A3B1C3D2，即酒香附的最佳炮制工艺为30%黄酒量，浸润1 h，过65目筛，烘烤温度60 ℃。

2.5 最佳工艺验证实验

为进一步验证最佳工艺的可靠性、稳定性，按最佳工艺组合A3B1C3D2进行3次验证试验，结果见表4。从结果可知，正交试验法优选的酒香附炮制工艺稳定可靠。

表4 验证实验结果 (%)

2.6 传统酒炙法与烘烤法比较

为比较烘烤法优选的最佳工艺与传统酒炙法制备样品的差异，取同一批香附药材，分别按照上述优选的最佳工艺组合和传统酒炙法进行3次比较试验，结果见表5。酒香附传统酒炙法炮制工艺参照《全国中药炮制规范》1988年版[16]：取香附碎块或片加黄酒拌匀，闷透，置于锅内，用文火加热，炒干，取出放凉。每100 kg香附用黄酒20 kg。由结果可知，传统酒炙法与烘烤法制备的样品中α-香附酮、总黄酮的含量RSD均大于5%，差异较大，而浸出物含量变化不大。传统酒炙法炮制的酒香附表面呈红紫色，偶见焦斑、焦屑，而在烘烤法中由于烘烤温度较低，无焦斑、无焦屑，外观性状优于传统酒炙法。

表5 两种炮制方法比较 (%)

3 结论与讨论

本试验参照相关文献[17-20]，改进了紫外-可见分光光度法、HPLC法测定香附药材中总黄酮、α-香附酮含量的方法，改进后的方法准确可靠、重复性好，可用于香附的质量评价研究，为香附多指标质量控制方法的建立提供了科学依据。

香附药用历史悠久，炮制方法众多，传统的酒炙香附采用直火炮制，炒制温度、炒制时间等工艺参数难以量化，不易控制。本试验以烘烤法替代传统的酒炙法，以α-香附酮、总黄酮和浸出物的含量为考察指标，采用综合加权评分法对各指标进行综合分析。实验结果表明，香附的粒度和烘烤温度是显著的影响因素，这可能与香附的主要药效成分为挥发油的特性有关。结合最佳工艺验证试验和与传统酒炙法的对比试验，最终确定了酒香附的最佳炮制工艺为30%黄酒量，浸润1 h，过65目筛，烘烤温度60 ℃。本研究结果为酒香附炮制工艺的改进和生产工艺参数的量化奠定了基础。