段滇宁，陈超，杨润泽，洪麒翔，陈洪博，2*，唐姝，张晓辉

(1. 龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364012；2. 福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，福建 龙岩 364012；3. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

热应激影响动物精神状态、生产性能、健康状况，造成多种器官的损伤，甚至导致动物猝死，热应激造成的经济损失已在世界范围内广泛报道[1]。与哺乳动物相比，家禽由于代谢旺盛、生长速度快，羽毛丰厚、皮肤没有汗腺等特点而更容易受到热应激的损伤[2]。作为一种非特异性应激源，热应激导致多器官受损。前期研究证实，热应激对鸡心脏组织造成严重的伤害[3-4]。肺脏是机体进行气体交换的场所，热应激后鸡的呼吸次数明显增多。然而，目前对热应激后鸡肺脏组织损伤研究缺乏。

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是细胞内一类高度保守的蛋白质，保护细胞免受应激原刺激，在许多生理过程中起着至关重要的作用，如蛋白质折叠、运输和组装。根据分子量不同，将HSPs分为几个家族，如小热休克蛋白家族、HSP47、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110[5]。前期研究表明，HSPs能保护心肌细胞免受热应激的影响，HSPs过量表达后可降低热应激对心肌细胞的损伤[6-7]。肺脏作为机体重要生命器官，在气体交换、参与代谢等方面具有重要作用，然而热应激对呼吸系统的损伤及肺脏组织内HSPs的表达变化规律仍不清楚。本试验旨在通过急性热应激处理，观察热应激后肉鸡肺脏组织形态学变化，在组织和细胞水平探讨肺脏组织HSPs的表达与组织损伤的关系，阐明热应激诱发呼吸系统机能障碍的发生机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人工气候培养箱(隔离器，RXZ-500D)为浙江宁波新江南机械有限公司产品；鼠抗HSP27、HSP60、HSC70、HSP72和HSP90单克隆抗体购自Enzo Biochem Inc.；山羊抗鼠IgG-HRP、BCA 蛋白检测试剂盒和化学发光底物检测试剂盒均购自上海碧云天生物公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、血钾检测试剂盒和血钙检测试剂盒购自南京建成生物技术公司；1日龄SPF雏鸡购自南京乾元浩生物技术有限公司，饲养于江苏省农业科学院实验动物中心。

1.2 试验设计

将60只1日龄SPF雏鸡饲养于温度(25±1)℃，相对湿度(45±5)%人工气候室环境中，自由采食和饮水，常规免疫。饲养至35日龄时，将SPF鸡随机分为对照组和热应激1、2、3、5和10 h组，每组10只，共6组。将热应激组鸡转移至(35±2)℃，相对湿度(70±10)%的人工气候室，试验开始后观察鸡的临床症状，分别按照试验设定的时间进行处理。试验结束后翅静脉采血取样，分离血清；颈静脉快速放血致死，迅速剖杀取材，采集试验鸡肺脏组织，一部分固定于10% 中性福尔马林溶液(24 h后换新的中性福尔马林溶液)，另一部分经液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.3 呼吸频率的统计

观察鸡腹部羽毛起伏次数，统计1 min腹部羽毛起伏的次数，即为呼吸频率。

1.4 血液生化、血气指标检测

取对照组和热应激组血清，用pH计测定血清pH值，血清中LDH、钾和钙浓度测定按照试剂盒说明书进行测定。

1.5 病理组织学检测

常规制作石蜡切片，然后切成5 μm的连续切片，HE染色，镜检。具体步骤参考文献[8]。

1.6 肺脏组织蛋白提取

取鸡肺脏组织100 mg，置于2 mL离心管中，加200 μL预冷的RIPA裂解液(含1% PMSF)，4 ℃条件下将组织用手持式研磨器快速研磨均匀，-20 ℃冰箱反复冻融3次后12 000 r/min离心5 min，用移液枪吸取上清至新的离心管中，即得到组织总蛋白，BCA法测定样品蛋白浓度，-80 ℃保存备用。

1.7 Western blot检测HSPs表达

将样品与6×蛋白变性缓冲液混合后煮沸变性5 min，冷却备用取25 μg样品进行检测，一抗1∶1 000,稀释，4 ℃孵育过夜，二抗1∶10 000稀释，室温孵育2 h，显影后进行灰度扫描，Quantity One软件进行分析。具体实验步骤参考文献[9]。

1.8 统计分析

用SPSS 20.0统计软件提供的多重比较的单因素分析对热应激组与试验中的差异进行统计分析。每个试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

2 结果

2.1 急性热应激对鸡行为指标影响

急性热应激对鸡呼吸频率影响如图1所示，试验开始前鸡呼吸频率为25次/min，热应激1～10 h呼吸频率极显著升高(P<0.01)，临床表现为热应激后鸡采食次数减少，饮水次数增加，站立鸡数量减少，俯伏休息鸡数量增多，鸡翅膀垂下、张口呼吸。热应激3 h后试验组鸡呼吸频率开始降低，但仍极显著高于正常对照组。

2.2 急性热应激对鸡血液生化、血气指标的影响

与对照组相比，热应激3 h后血清pH显著升高(P<0.05)，热应激1 h后血清pH呈升高趋势，但与对照组无显著差异，整个热应激过程中血清pH值都呈升高状态(图2A)。血清LDH水平均在热应激后呈极显著升高的变化(P<0.01)，LDH变化总趋势呈升高趋势，在热应激5 h组达到最高点，随后LDH浓度开始降低(图2B)。与对照组相比，热应激1 h后血钾浓度有升高趋势，但差异不显著(P>0.05)；随着热应激时间增加，血钾浓度开始降低，热应激5、10 h后血钾浓度显著减低(P<0.05)；热应激10 h 组血钾浓度高于热应激5 h组，但二者之间差异不显著(P>0.05)，见图2C。热应激后血钙浓度呈降低趋势，热应激5、10 h后血钙浓度显著减低(P<0.05)，热应激10 h组血钙浓度高于热应激5 h组，但二者之间差异不显著(P>0.05)，见图2D。

注：各组不同时间点与对照组相比，*：P<0.05差异显著，**：P<0.01差异极显著。下同

图2 热应激对鸡血清pH(A)、LDH(B)、钙浓度(C)及钾浓度(D)的影响

2.3 急性热应激鸡肺脏组织学变化

对照组鸡肺脏组织可见肺房内无异物出现(图3A)。热应激前1～3 h后，肺组织内血管尤其是肺泡壁毛细血管显著充血，肺房结构基本完整(图3B、图3D)。热应激5 h后肺房内充血性变化明显，肺房内有大量的红细胞存在(图3E)。热应激10 h肺房内的异物减少，但肺上皮细胞大量脱落，组织结构损伤严重(图3F)，气管黏膜高度水肿，黏膜的完整性受到严重的损伤，气管黏膜上皮细胞大面积脱落。

A,B,C,D,E和F分别为热应激0,1,2,3,5和10 h时的肺脏组织

2.4 肺脏组织中HSPs的表达

由图4可知，HSP27和HSP72在正常肺脏组织中含量较低，热应激后表达量极显著升高(P<0.01)。HSP27在热应激1 h后表达量极显著升高(P<0.01)，在热应激过程中一直维持较高水平。HSP72在热应激1 h后表达量显著升高(P<0.05)，热应激5 h后表达量极显著升高(P<0.01)，随着热应激时间延长，HSP72含量开始降低，但仍显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，HSP60的表达量在热应激1 h后显著升高(P<0.05)，而随着热应激时间增加HSP60表达量降低，与对照组无显著差异。HSC70作为结构型HSPs在热应激鸡肺脏组织表达变化无明显差异，始终维持在较高水平。热应激后鸡肺脏组织内HSP90表达量呈下降趋势，热应激50 h后表达量显著升高(P<0.05)，随着热应激时间延长，HSP90含量开始降低，但与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

热应激是一种非特异性的应激原，它会影响家畜的健康甚至导致死亡。课题组前期研究揭示了热应激可对鸡心脏、肝脏和肾脏造成严重损伤[8,10-11]，对肺脏损伤研究报道较少。热应激发生时，动物会出现喘息、频繁呼吸，导致机体CO2排出过多、血液pH值升高等现象。为了保持机体电解质和酸碱平衡，肾上腺皮质分泌醛固酮增加，血液中Na+、K+排出量升高，引起血中钠、钾离子水平下降，导致血浆渗透压降低[12]。本试验中随着热应激时间增加，鸡饮水增加，俯卧休息增多，翅膀伸展频次增加，呼吸频率的明显升高，肺脏通气过度，热应激1～2 h维持在较高频率，随着热应激时间延长，呼吸频率降低，但仍极显著高于对照组。呼吸加快导致大量CO2排出，使血液pH值升高，在热应激试验过程中一直维持较高的状态，表明机体发生呼吸性碱中毒，机体CO2浓度降低可引起脑血管收缩和血流量减少，导致脑组织缺氧，使鸡由开始烦躁不安状态转化为精神沉郁、萎靡不振，甚至昏迷。与对照组相比，热应激后3 h后pH与对照组差异显著，但热应激后5 h pH与对照组无显著差异，可能原因是热应激3 h以后鸡群慢慢适应所处的环境，呼吸频率开始降低，通过大量饮水、体内某些蛋白大量表达来发挥保护作用(如热休克蛋白等)，缓解机体呼吸性碱中毒。本研究中发现血钾浓度在热应激后降低，原因可能是为了维持机体的酸碱平衡，肾小管上皮细胞代偿性排出H+减少(保酸)，相应的排出K+增多，细胞外液K+进入细胞内交换H+，因此使血钾浓度降低。另外，由于血液pH值升高，机体分泌有机酸增多，有机酸与钙离子大量结合，导致血钙浓度下降，血钙浓度降低，引起神经肌肉细胞阈电位下降，肌肉组织兴奋性升高，使鸡出现肌肉抽搐，甚至发生痉挛。LDH被广泛用作细胞损伤的标志物，本研究中热应激后鸡血清LDH水平明显高于对照组，表明热应激对鸡组织细胞可造成一定的损伤。另外，课题组前期研究发现在热应激2 ～ 3 h时鸡有死亡现象，但随后死亡率反而降低，热应激10 h以后鸡群又开始出现死亡[4，13]，而本试验中则没有出现鸡因急性应激所致的应激性猝死现象，这可能与饲养环境中空气流通、湿度和温度控制较好有关[1]。

同一指标在热应激不同时间进行比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

病理组织学检测发现热应激鸡肺脏呈现明显的动态病理变化，主要表现为支气管扩张充血，肺小叶毛细血管扩张，肺房内有水肿液和红细胞，气管黏膜的完整性受到严重的破坏，肺房上皮细胞脱落、破裂会严重影响肺脏的呼吸功能，可能是造成热应激缺氧及呼吸性碱中毒的主要原因。目前热应激引起肺脏细胞损伤的机制尚不明确，但是通过本试验的观察与综合分析可以认为，热应激对组织的损伤机理与组织的氧化损伤以及细胞内有毒物质的积累有着密切的联系。在正常生理情况下，体内自由基产生和清除处于动态平衡状态，当动物受到热应激时，会使得自由基的产生急剧增加，而自由基清除的能力不足，造成体内自由基蓄积，导致动物的组织氧化受损。

热应激反应是自然界存在的应激类型中最普遍的一种，从原核生物(如细菌)到人类在高温环境下均可选择性合成一类蛋白质，即热休克蛋白，这类蛋白质参与机体的应激反应，具有多种功能，包括赋予细胞耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣以防止蛋白聚集，对抗正常的细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡，现已成为研究应激领域中的热点方向[4，13]。当动物机体受到外界多种应激刺激时，细胞内的HSPs会被大量合成和消耗，以抵抗外界刺激对机体的损伤，从而维护细胞的正常功能和代谢。大量研究表明，HSPs在抗应激损伤过程中起重要作用，对心脏、肝脏、肾脏等组织器官起保护作用[5，14-15]，而HSPs在肺脏内的表达变化规律尚不清楚。HSP27的主要功能是在体内提供耐热性、细胞保护以及在应激条件下维持细胞存活，它通过不依赖于ATP的伴侣作用抑制蛋白质聚集和稳定部分变性蛋白质，从而确保HSP70复合物的再折叠[15]。HSP60在线粒体蛋白质的运输和维护以及线粒体DNA的传递和复制中起着重要作用[16]。在热应激条件下，HSC70被动员来保护细胞，并通过修复因应激改变其构象的蛋白质来帮助HSP70发挥其保护功能[17]。HSP72可与其他蛋白结合，从而稳定现有蛋白的聚集，并介导在细胞质和细胞器中新翻译蛋白的正确折叠[14,18]。细胞受到应激刺激后HSP90在细胞中起到防止蛋白非特异性聚集的作用，保证蛋白质进行正确折叠，维持细胞内稳态[5]。本研究发现热应激导致鸡肺脏组织内HSPs表达量出现明显变化，其中HSP27和HSP72两种热休克蛋白升高最显著，以HSP72表达变化最大。HSP72在正常肺脏组织中表达量较低，在热应激后表达量开始显著升高，在热应激5 h表达量达到最高，随后开始降低。HSP27在热应激1 h后呈现极显著升高状态，在整个热应激过程中表达量一直维持在较高水平。HSP60、HSC70和HSP90在鸡肺脏组织中均有较高的表达量，热应激1 h后HSP60表达量显著升高，随着热应激时间延长表达量开始降低，但仍维持在较高水平，HSC70作为结构型HSPs，热应激后表达量无明显变化，HSP90在热应激后表达量有先降低后升高的趋势，与对照组相比无显著差异。研究结果表明热应激后肺脏组织中HSPs表达量发生明显变化，HSPs表达量的提高可能与提高组织细胞抗热应激能力相关。

综上所述，热应激能引起鸡血清pH值和LDH含量升高，血钙和血钾浓度降低，造成肺脏组织严重损伤，多种HSPs在热应激的鸡肺脏组织中表达量升高。HSPs在热应激后高表达可能与机体损伤修复中的保护作用有关。然而，HSPs的确切作用需要进一步研究阐明。