蔺 欢，王俊娟,2，孙振婷,2，朱伟东，叶武威，2，阴祖军，2*

(1 中国农业科学院 棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000； 2 郑州大学 农学院，郑州 450000；3 中国农业科学院 深圳农业基因组研究所，广东深圳 518000)

植物细胞通过短距离和长距离的通讯进行细胞间的交流，从而调节生物过程来协调生长和发育。为了确保正确的信号交流模式和功能调控，通过植物激素、移动转录因子、非编码RNA和多肽信号分子等几种信号分子的胞间通讯模式来实现这种需求[1-2]。植物激素从一个细胞到另一个细胞进行定向转运，具有特异性和方向性，这就为植物的胞间交流提供了一种特定的发育模式[3-5]。植物的胞间互作主要由激素类的亲脂性小分子化合物完成，如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸、乙烯和油菜素内酯等, 这些激素存在于各个器官组织并参与植物的不同生长发育阶段和复杂的胁迫应激等生命过程，它们作为信号分子在胞间通讯和交流过程中发挥着重要的作用[6-7]。再者，转录因子(transcription factors，TF)通过胞间连丝进行直接同向转运信号，这种胞间信号传导方式也得到了广泛的研究。转录因子是编码特定转录因子蛋白的基因家族类型，它们的靶基因形成一种调节因子，参与调控植物生长发育和非生物应激反应相关基因的抑制和激活，如研究较为成熟的NAC基因家族主要参与调控植物的抗旱、耐寒和耐盐碱[8-10]，烟草(Nicotianatabacum)植物中bZIP(basic leucine zipper)家族成员中的EcbZIP17，可以提高转基因植株的发芽率、生物量和存活率[11]。更有趣的是，microRNAs也被认为是胞间信号分子，研究证实miRNA165/166可以在茎顶端分生组织和根尖分生组织短距离移动，调控原生木质部细胞的生长发育过程[12-13]。作为胞间通讯的信号肽分子在动物体内已经被研究了很多年，然而在植物中，人们历来对非肽类亲脂性植物激素(如生长素)的高度关注，却使信号肽的重要性显得相形见绌。近年来，大量的生化和遗传研究表明, 植物信号肽同样也参与了植物的生长发育和应激反应过程, 包括细胞增殖、维管束形成、自交不亲和的识别、分生组织的细胞平衡和组织脱落、防御反应等[5, 14-16]。此外，富亮氨酸重复受体样激酶(LRR-RLKs)等一些受体的发现和鉴定，也进一步强调了信号肽在植物发育中的重要性[16-17]。

1 植物小分子肽的发现

胰岛素是人类在动物体内发现的第一个小分子肽，在动物生理调节过程中发挥着重要的作用，随后在此基础上又发现了众多的小分子肽，它们对动物生长发育和抵抗疾病方面都起着非常重要的作用[6]。而在植物体内小分子肽的研究还未超过30年，Pearce等于1991年在番茄(Solanumlycopersicum)中发现了植物中的第一个小分子肽——系统素。成熟的系统素包含18个氨基酸残基，由一种叫做原系统素酶的200个氨基酸前体加工而成，主要参与调控番茄对病虫害引起的伤害反应[18-19]。

小分子肽是重要的胞间信号感应分子，主要参与调节植物的生长发育过程和应答生物和非生物胁迫的应激反应。已有研究表明，肽信号在植物胞间通信过程中发挥了比预期更大的作用。一些信号肽在植物生长发育过程中起信号传导作用，而另一些则参与防御反应或共生过程[20-21]。大多数的小分泌肽蛋白前体都含有前体结构域，需要经过加工处理过程才能获得具有生物活性的成熟肽。迄今为止，大多数具有特征的植物肽作为小信号肽或抗菌肽来源于较大的非功能性前体蛋白，该前体蛋白无生物活性，因此由 N 端信号肽序列引导蛋白进入分泌途径。这些新类型的信号肽进一步增加了植物小肽研究的复杂性，尽管它们的数量仍然有限，但是人们对其研究发现的翻译证据和功能特征还具有争议[22-23]。目前被普遍承认并可能起激素作用的植物小分子肽包括以下几类：系统素(Hyp Sys)、CLAVATA3/胚胎周围区域相关肽(CLE)、C端编码肽(CEP)、植物磺化激动素(PSK)、S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)、早期结瘤蛋白(ENOD40)、一类参与花器官脱落的多肽(IDA)、快速碱化因子(RALF)、表皮模式因子1和2(EPF1、EPF2)、根生长因子(RGF)/GOLVEN(GLV)/CLEL肽、绒毡层决定因子(TPD1)、气孔蛋白类肽9 (EPFL9)等[5-6, 23-24]。

2 植物小分子肽的结构特点与系统分类

成熟的肽段很小，通常由20个氨基酸残基组成，极少数前体的全长会超过120个氨基酸残基，并且在植物体内通常以很低的生理浓度存在，但是成熟肽段在同源基因之间具有极高的保守性，这对家族成员的挖掘提供了方便[20]。由于信号肽在生物体内的表达水平极低，因此对小肽的挖掘和研究进一步复杂化，这对研究者们将是一个非常大的挑战[25]。

肽信号可分为分泌型多肽和非分泌型多肽。Matsubayashi等[26]将分泌型肽信号分为两类:一类是通过复杂的翻译后修饰，然后进行广泛的蛋白水解过程而产生的，被称为翻译后修饰小肽；另一类以存在多个分子内二硫键为特征，并且此类信号肽中一些经历蛋白水解过程，一些不经历蛋白质水解过程，但都被统一定义为富含半胱氨酸多肽[5, 19]。华春等[27]在2015年又将所有植物的多肽信号根据是否分泌、是否存在N端信号、胞外还是胞内起作用分为四大类: 胞外起作用的翻译后修饰分泌型小肽、胞外起作用的富含半胱氨酸分泌型多肽、胞外起作用的非分泌型多肽和胞内起作用的非分泌型多肽[5, 18, 28-29]，所包括的基因及其功能如表1所示。

在某些情况下，非分泌型多肽既可通过胞内信号转导调控细胞功能，也可从受伤的细胞中释放出来直接参与植物的防御反应等[27]。系统素属于胞外起作用的非分泌型多肽，是一种从番茄叶片发现的长为18个氨基酸的肽，它主要在受伤部位释放信号。这类肽能够引起悬浮液培养细胞的碱化，诱导防御蛋白酶抑制剂蛋白的合成，并系统地发出信号，激活整个植物的防御基因[18-19]。早期结节蛋白因子ENOD40是胞内非分泌型多肽的代表之一，该基因的显著特征是存在短的开放阅读框ORF(少于100个氨基酸)，在多种豆科植物中都高度保守，主要是编码的短肽发挥功能[30]。先前的研究发现，ENOD40基因的一些功能可能是由编码的RNA结构决定，主要在根瘤器官的形成和生长中具有重要作用，并参与调控豆科植物与细菌或真菌的共生，在非共生植物发育过程中也普遍发挥作用[31-33]。最新的一项研究也支持了该结论，定位于核小体的RNA结合蛋白1 (RBP1)首次在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被鉴定，作为一种长链非编码RNA(lncRNA)，它可与早期结瘤基因ENOD40 (EARLYNODULIN40)相互作用，重新转运至细胞质参与蒺藜苜蓿共生结瘤的形成[30]。拟南芥(Arabidopsisthaliana)中与RBP1进化关系最近的两个同源物被称为核小体RNA结合蛋白(nuclear speckle RNA-binding proteins, NSRs)，它们被鉴定为mRNA的特异可变剪接调节因子，并在体内识别其他长链非编码RNA剪接竞争因子，从而调节侧根的形成[34]。虽然ENOD40似乎具有多种功能，但其活性分子的调控路径和表达机制尚不清楚。

分泌型多肽包括翻译后修饰小肽和富含半胱氨酸多肽，主要通过自由扩散方式分泌到胞外空间，对相邻细胞的命运起决定性作用[27]。一些翻译后修饰小肽的特征是结构上存在由特定修饰酶介导的翻译后修饰，如酪氨酸硫酸化(PSK、PSY和RGF)、脯氨酸羟基化(现发现的小肽中除了PSK没有脯氨酸残基,其他所有翻译后修饰小肽都有羟脯氨酸残基)和羟脯氨酸阿拉伯糖基化(PSY1、CLV3、CLE2、CLE9和CLE-RS2)以及连续的蛋白水解过程，这些修饰可能会在构象上改变肽的活性或非活性状态。它们的成熟肽段很短，一般少于20个氨基酸，是蛋白质水解过程中的结果[27, 35]。这些多肽最初翻译成具有N端分泌信号的约100个氨基酸残基的前体多肽，然后通过翻译后修饰化及位于内质网和高尔基体中的加工酶的作用，形成具有特殊生物功能的成熟多肽[27, 35]。另一个分泌型信号肽是富含半胱氨酸多肽，它的特点是在整个肽段中存在偶数个半胱氨酸(Cys)残基并形成分子内二硫键。富含半胱氨酸多肽通常要比翻译后修饰的小肽(少于160个氨基酸)大得多，带正电荷，大约含4～16个半胱氨酸残基。这些残基对成熟肽的正确构象折叠是不可或缺的。与翻译后修饰小肽不同的是，目前并没有研究证实富含半胱氨酸多肽存在翻译后修饰过程[28]。而与翻译后修饰小肽类似的是，富含半胱氨酸多肽同样包含一个保守的 N 端信号肽，通过分泌途径引导多肽到达正确的细胞位置，并且它们C端的成熟肽段也高度保守[36-37]。

3 植物小分子肽的功能

3.1 翻译后修饰小肽

全长mRNA前肽进入分泌通路后，N端疏水信号肽被信号肽酶剪切。翻译后修饰小肽(PTM)和富含半胱氨酸多肽(Cys-rich peptides)会通过不同的途径产生成熟的活性肽。到目前为止，在植物中发现，所有翻译后修饰小肽都历经三种翻译后修饰方式的其中一种或多种：络氨酸(Tyr)硫酸化(黄色)，脯氨酸(Pro)羟基化(红色)和/或羟脯氨酸(Hyp)-阿拉伯糖基化(绿色)，激活从前体蛋白序列中裂解修饰的肽段，从而得到一个不超过20种氨基酸残基的翻译后修饰小肽(PTM)[23](图1)。许多参与植物发育、防御反应、细胞识别和胞间通讯的肽家族都属于这个亚家族[26]，这些肽作为信号分子被特定的受体感知。虽然PTM肽下游在分子和生理活动方面已经取得了进展，但具体的作用模式和调节机制尚不清楚。

图1 翻译后修饰小肽和富含半胱氨酸多肽的加工修饰过程[5]Fig.1 Processing and modification of post translationally modified small peptides and Cys-rich peptides[5]

C端编码的多肽CEPs(C-terminally encoded peptides)，是由15个氨基酸残基组成的肽段，其中有2～4个脯氨酸残基可能被羟基化，从而影响细胞的生物活性[51-52]。拟南芥中CEP1的过表达导致根系生长停滞[51]，并且在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中发现CEP1的过表达或应用外源合成的CEP1均可抑制侧根的形成，增强根瘤的形成，诱导根周期性的膨大[52-53]。CEP5表达水平的改变也会影响拟南芥在地上组织的生长发育[54]。此外，Tabata等[71]在拟南芥中发现了CEP基因的两个受体EPR1和CEPR2。迄今为止，CEP多肽在序列、长度、结构和翻译后修饰上的变化已经被鉴定，并且证明了通过CEP受体(CEPRs)控制氮(N)的需求信号，参与豆科植物的根瘤形成和侧根发育[55]。

CLE[CLAVATA3 (CLV3)/胚胎周围区域]家族是PTM 肽中研究最早且最深入的小分子肽[38]。在拟南芥中，CLV3肽通过维持茎顶端分生组织的干细胞数量，发挥调节茎顶端分生组织的作用。自从发现了CLV3基因，随后在双子叶植物、单子叶植物、苔藓和藻类中也逐渐发现了CLE家族的存在，多项实验证明该家族在植物的不同发育过程和特异性组织中发挥重要作用，包括茎顶端分生组织和根顶端分生组织的发育、种子发育、维管束形成、结节形成、胚胎和胚乳的发育、根系结构的调节以及形成层中的干细胞稳态的调控等方面[24, 39, 72]。此外，还发现CLE基因在植物应对环境刺激的反应中也发挥各种生物学作用[73]。更重要的是，CLE家族作为一种肽配体，与多种受体的关系也多种多样，一个受体激酶可以作为不同肽的受体，一个肽也可以被不同的受体识别。例如，在韧皮部和邻近细胞中表达的TDIF/CLE41/CLE44肽可被原形成层细胞质膜上的富含亮氨酸重复受体样激酶(LRR-RKs)TDR/PXY受体识别，并调控原形成层细胞的生长发育[72]。实验结果表明CLV1不仅是CLE2的受体，也是CLV3的受体，前者配体-受体模块主要系统地调节豆科植物根瘤的数目，后者主要在茎顶端分生组织维持期间发挥功能[74-75]。

植物中发现的含硫酸酪氨酸1 (PSY1)肽是一种含有18个氨基酸残基的糖肽，SY1和PSK在纳摩尔浓度下促进细胞显著增殖和扩张。拟南芥基因组中发现了2个编码PSY1前体同源物的基因，它们在保守的PSY1结构域内具有显著的相似性，并参与蛋白水解过程中碱性氨基酸残基的调控[44]。近期研究发现PSYR1为PSY的受体，它们都可通过调节水杨酸盐和茉莉酸盐参与植物的防御反应[76-77]。再者，富含羟脯氨酸糖肽(HYPSYS)是由15～20个氨基酸组成并含有4～7个可能羟基化的前位残基的另一种糖肽，主要存在于茄科植物中[78]。HYPSYS信号肽可以激活蛋白酶抑制剂，在防御昆虫等食草动物方面发挥了重要作用。研究发现该信号肽在烟草中过度表达时，可以增强植物对棉蚜幼虫的抗性[79]。此外，根生长因子(RGF/CLEL/GLV)肽段长为13～18个氨基酸，该成熟肽是通过具有C-端保守基序的前体蛋白进行蛋白水解裂解而产生[57, 80]。调控花序脱落的IDA(inflorescence deficient in abscission)也是一种多肽信号，在花器官中正向调节花器官脱落，它和另外5个同源基因IDA-like (IDLs)共同享有一个C端附近的保守区域，这个保守区域是一段很短的合成肽，功能与 IDA相似[56]。由此看来，信号肽在根的重力作用、根尖分生组织的维持，根毛、侧根和芽的生长和发育，以及花序脱落、应对环境胁迫等方面都发挥着重要的作用[80-81]。

3.2 富含半胱氨酸多肽

富含半胱氨酸(Cys)的肽段，其特征是包含2～16个半胱氨酸残基的功能结构域。富含半胱氨酸多肽通常不需要前体蛋白的水解过程，但也有例外。富含半胱氨酸肽的激活是在保守的半胱氨酸残基之间形成二硫键时完成的，从而使肽具有活性构象[5](图1)。但它们的肽段长度和原始蛋白序列在肽段和物种之间都存在很大的差异，每个富含半胱氨酸的肽类都有一个半胱氨酸残基的数量特征和位点差异特征。位点差异会影响分子内二硫键的形成，对适当的类特异性次级折叠和生物活性至关重要[23](图1)。实验证明抗菌肽AMPs能够减轻宿主的防御反应，同时会产生对病原体的持久抵抗。而大多数已发现的富含半胱氨酸的植物肽被认为在植物与微生物的相互作用中发挥着和抗菌肽相似的作用，并且已经从植物的根、叶、茎、花和种子中分离出来。

目前为止，植物防御素(PDFs)是研究最深入的富含半胱氨酸多肽，长度为5 kD，该信号肽的主要特征是由1个螺旋形和1个三股的环状结构构成，并由4个二硫键稳定该结构[23, 82]。PDFs广泛存在于单子叶和双子叶植物中，属于致病相关的蛋白家族。相关实验认为多种PDFs的外源过表达增加了模式植物和多种作物对不同真菌和细菌的抗性[83]。PDFs的其他相关活性酶也被报道，包括胰蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白质合成抑制剂和阻断钠通道因子。此外，研究表明一些PDFs似乎在花粉识别、非生物胁迫耐受和根生长抑制等方面也发挥着重要作用[83]。

其次，硫蛋白(THIONINs)存在于单子叶和双子叶植物中，属于PR13(pathogenesis-related 13)家族，它们对细菌、真菌、酵母、昆虫幼虫和哺乳动物细胞等均产生毒性[84]。环肽(cyclotides)是一种特殊类型的打结肽，其特征是具有头尾环化主干的长约30个氨基酸残基的肽段，因此是一种超稳定肽。环肽具有广泛的活性，包括在真菌、细菌、病毒、昆虫、软体动物、藤壶和线虫等体内抑制生物活性[23, 85]。类HEVIN肽是含有6～10个半胱氨酸残基的4 kD几丁质结合肽，来源于前体蛋白。目前为止，在单子叶和双子叶植物中只检测到少量的类HEVIN肽[86]。实验证明类HEVIN肽的过表达导致植物对各种真菌和卵菌病原菌的抗性增强[87-88]。因此，基于其与几丁质的结合能力，提出了它们在植物防御过程可能发挥重要的作用[89]。

另外，分子量约为5 kD快速碱化因子(RALF)肽段来自于前体蛋白的C末端，是利用质谱技术在烟草叶片中检测到的。利用磷蛋白组学方法，野蔷薇(RosamultifloraThunb.)RLK1类激酶(Cr-RLK1L)受体家族中的FER(feronia)被鉴定为RALF受体，随后，提出了信号转导通路的模型[90-91]。表皮模式因子(EPF)和与表皮模式因子类似的肽段(EPFL)，在C端成熟肽区包含6～8个保守的半胱氨酸残基，长度约为45～76个氨基酸，由前蛋白衍生而来[23]。研究发现EPF/EPFL基因存在于苔藓、单子叶植物和双子叶植物中，体外过表达EPF1、EPF2、EPFL4和EPFL5均会抑制气孔的发育[65-66]。相反，EPFL9 的过表达导致植物气孔密度的增加，并且近期实验证实EPFL9 参与了气孔通路的光响应[36]。

4 CLE和RALF小分子肽的研究进展

4.1 CLE小分子肽的研究背景和研究进展

CLE(CLAVATA3/胚胎周围区域)小肽作为翻译后修饰小肽的代表，是近几年植物信号肽中最热门的研究课题之一，CLE基因编码保守的C末端CLE基序的小分泌肽。成熟的CLE肽是CLE基序经过翻译后修饰(如羟基化和糖基化)，而后从其前体蛋白中分离出来的一段小肽[73, 92-93](图1)。CLE基序是一个包含14个左右的保守氨基酸残基的序列(KRXVPXGPNPLHNR)，称为CLE基序或CLE结构域，是许多植物细胞增殖和分化机制的重要调控因子[73, 94-95]。但也有报道指出CLE保守基序长度为12～13个氨基酸残基[96]。

CLE信号肽广泛存在于自然界中，其名称最早起源于两个家族成员：拟南芥的CLV3基因和玉米(Zeamays)的ESR基因家族[38, 96-97]。CLV3和ESR序列共享14个氨基酸残基，是一段短而保守的蛋白质序列，它们的结构和功能相似但并不相关，ESR基因主要在玉米胚乳的胚芽周围区域特异性表达，而CLV3主要控制茎尖分生组织中干细胞的命运[38, 98]。CLE保守结构域是CLE蛋白的功能域，因此含有CLV3 结构域的蛋白序列均被定义为CLE基因家族[38, 92, 99]，而CLE蛋白由N端信号肽SP(Signal Peptide)、C端CLE保守基序和中间的可变区域组成。SP是一种疏水信号肽，可变区(相对于CLE基序的N端)编码的蛋白通常没有特定功能，可以用其他基因的核苷酸代替，CLE保守基序是重要的功能结构域[41-42, 96]。分泌的信号肽就像激素一样也被证明可以调节植物的生理反应，参与植物细胞间的交流[100-101]。多细胞生物的生长发育和环境应激反应都依赖于细胞间的通讯，所有生物都利用细胞表面的受体来感知来自自身、非自身或修饰自我的胞外信号[73, 102]。而肽信号分子的级联就是以配体-受体的方式将信号从一个细胞传递到另一个细胞。然而，信号肽配体-受体结合并不仅仅是一对一的单一作用，肽通过不同的受体激活多个下游信号肽，受体也会根据不同的信号肽传递不同的信号。例如，CLE1发挥功能在很大程度上依赖于CLV1，CLE11不那么依赖，而CLE22完全不依赖，并利用CLV1以外的受体发挥作用，表明这些CLE在受体靶点上存在相当大的差异[103-104]。

近期一项研究首次表明，在植物孢囊线虫(cystnematodes)和丛枝菌根(Arbuscularmycorrhiza,AM)中也发现了CLE基因家族，并且许多基因包含高度保守的CLE结构域[103-104]。Guo等从拟南芥孢囊线虫中分离到一类新的CLE肽，其功能与CLE41和CLE44基因编码的B型CLE肽TDIF(管胞元素分化抑制因子)相似，并且进一步证明了TDIF-TDR (TDIF受体)-WOX4通路促进原形成层分生组织的细胞增殖，参与调控甜菜孢囊线虫的寄生关系[38, 42-43]。有证据表明，植物根组织中的线虫病原体也分泌类似植物CLE肽的配体，它们将选定的寄主细胞修饰成多核取食位点，并在功能上模仿一种植物肽，参与胞间信号传导，以达到寄生的目的。丛枝菌根在真菌与植物共生中起重要作用，主要促进菌根的发育，有利于植物根系更好地吸收养分[105-106]。

CLE信号肽也存在于多种植物中，一项研究表明在小立碗藓(Physcomitrellapatens)中发现了15个CLE基因，随后在拟南芥、水稻(OryzasativaL.)、杨树(Populustrichocarpa)、大豆(Glycinemax)和其他多细胞植物中也逐步发现了CLE基因[105-108]。CLE家族在模式植物拟南芥中得到深入研究，32个基因成员可被分为A型和B型两大类型，由于不同物种间的差异，如果将拟南芥的32个CLE成员和其他物种的CLE成员共同进行进化分析，分类情况可能会超过两类[20]。由于CLV3发现最早，因此是A类型基因中研究最为深入和透彻的一个基因，在拟南芥中主要促进根尖分生组织和茎尖分生组织的细胞分化[19]。B类型中最具典型特征和功能的CLE基因有4个(CLE41/TDIF/CLE44/CLE46)，主要促进拟南芥维管束细胞增殖，延缓韧皮部和木质部细胞群分化，调节维管干细胞的稳态。大量研究证明CLE分泌的肽在各种植物的信号通路中起关键作用，如伤口反应、花粉不亲和性，特别是在茎尖分生组织和根尖分生组织中维持干细胞群稳态期间发挥了重要作用[108-110](图2)。此外，有少量研究发现小分子肽还参与植物应对非生物胁迫的过程。例如，拟南芥CLE25在维管组织中表达，并与BAM受体结合通过调控脱落酸的积累来诱导气孔关闭，从而增强拟南芥对脱水胁迫的抵抗能力。因此CLE25-BAM通路可能在脱水反应中作为长距离信号分子之一发挥着重要的作用[106]。

可见，植物中CLE信号肽主要调控茎尖分生组织和根尖分生组织及器官在静止中心(QC)周围的干细胞数量和大小的稳定性，而植物干细胞的增殖分化是各种器官和组织的主要来源[93, 111]。因此，与植物激素类似，肽信号也是植物生长发育和应对生物和非生物胁迫的重要信号通路。

4.2 RALF小分子肽的研究背景和研究进展

RALF(快速碱化因子)是一种大小约为5 kD的小分子肽，首次在烟草叶片提取物中发现，能够引起烟草细胞悬浮培养基的快速碱化，同时激活细胞内有丝分裂原活化蛋白激酶。随着各个物种全基因组测序的基本完成，在多个物种中都发现有该基因的存在，最近在紫花苜蓿和番茄中也发现了RALF基因[60-61, 112]。快速碱化因子(RALFs)是植物界广泛存在的富含半胱氨酸的多肽，尽管比翻译后修饰小肽(CLE、CLV3和RGF等)更大，但它们仍然很小(小于160个氨基酸)[113]。获得N端肽序列之后从烟草叶片文库中分离出一个前体cDNA，该前体编码了一个大小为115个氨基酸残基的蛋白序列，其C端包含一个RALF保守结构域，而大小为49个氨基酸残基的活性肽就是从保守的C端释放出来的，N端信号肽序列也是相对保守的，中间序列基本没有显著特征。此外，C端保守结构域中含有丰富的半胱氨酸，通常含有4～6个半胱氨酸残基，相邻两个残基之间会形成分子内二硫键[28, 40]。

图2 CLE在成熟拟南芥不同组织中的表达示意图[23]Fig.2 The schematic representations of CLE expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[23]

通过对EST数据库的检索发现，RALF基因广泛存在于双子叶植物、单子叶植物和裸子植物中，如拟南芥、杨树、甘蔗(Saccharumofficinarum)、番茄等其他茄科(Solanaceae)植物[28, 112, 114]。拟南芥中已经鉴定出了40个编码RALF和RALF-like (RALFL)基因，并在不同器官和组织中表现出不同的表达模式[115](图3)。研究表明，AtRALF1和AtRALF23在根中特异性表达，其在拟南芥中的过表达表现出幼苗的根细胞减小，生长缓慢[116-117]，另外的研究还发现了拟南芥的两个受体BUPS1和BUPS2及其肽配体RALF4和RALF19均在花粉管中表达，参与花粉管的生长发育，维持花粉管的完整性，表明RALF4和RALF19的功能依赖于调控花粉表达的富亮氨酸重复扩增酶(LRX)蛋白，因此该蛋白在细胞壁的发育中也具有重要作用，但是其作用方式尚不清楚[117-118]。研究进一步证明，RALF4作为肽配体，其N端信号肽区域(包括YISY结构域)对其生物学功能至关重要，C端的保守功能域能够与受体LLG结合，但与LLGs的作用较弱而与BUPS-ANX受体的相互作用较强[119]。其次，番茄的RALF基因也表现出花粉特异性表达，它在特定的发育期内抑制花粉管的伸长，但不影响花粉活力、水化或早期萌发[61, 112]。另外，前人从杨树cDNA文库中也分离到了两种独特的杨树RALF肽的cDNAs：PtdRALF1和PtdRALF2。实验研究表明，PtdRALF1在杨树茎端、叶柄、叶、茎、根、芽、树皮中都有不同程度的表达水平；相比之下，PtdRALF2在大多数组织中也都有表达，但在幼叶和成熟叶中却几乎没有表达或者表达水平极低。然而，研究也显示在外源茉莉酸甲酯(MeJa)处理后，杨树体内的RALF表达量明显降低，尤其是PtdRALF2[112]。

图3 RALF在成熟拟南芥不同组织中的表达示意图[122]Fig.3 The schematic representations of RALF expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[122]

此外，众多的相关研究均发现，RALF作为一种小肽更可能参与植物的生长发育过程而不是防御反应。例如，RALF信号肽能抑制番茄植株的根系生长，但不能诱导抗草食动物蛋白酶抑制剂的产生[28]；其次，RALF肽在果实成熟的某一阶段有中度甚至高度表达水平，但在防御信号通路的表达量并不显著；最后，对含有生长调节剂的植物进行非生物胁迫处理后，这些基因的mRNA水平并无显著变化[28, 114]。但是2013年的一项研究表明，AtRALFL8在根中被多重胁迫所诱导，但在拟南芥中过表达时，又增加了拟南芥在干旱胁迫和线虫感染下的敏感性。因此，AtRALFL8的诱导说明植物通过不同激素信号通路使细胞发生复杂的生理变化，从而产生保护它们免受胁迫的生理机制[120]。该研究结果表明，在同时存在的生物和非生物胁迫的环境下，植物可以产生类似于AtRALFL8这样的信号肽来诱导细胞壁重塑以应对多种外界压力。这一实验结果推翻了先前的RALF碱化因子仅参与植物生长发育而不是防御反应的结论。然而，最新的研究又发现，在病原体触发植物免疫反应后，RALF23及其同源蛋白RALF33通过蛋白水解酶激活，从而抑制了植物的免疫反应[121]。由此得知，大量物种的RALF信号通路和基因功能都还没有得到证实，本文的概述为未来快速碱化因子RALF的研究提供了一个重要的方向。

5 总结与展望

植物信号肽分子是一种小肽，作为信号分子，正如传统植物激素一样，往往起到“四两拨千斤”的作用。多种植物小分子肽的研究表明，小分子肽是由前体蛋白加工而成的一种多肽，广泛存在于多种植物中，包括裸子植物、单子叶植物、双子叶植物、苔藓和藻类等植物，并且在植物的多种器官中都有不同水平的表达，参与了植物生长发育等许多生物学过程，说明它们在植物体内具有重要的调控作用。虽然植物信号肽的研究已经取得一些进展，但由于功能肽段很短，在植物体内的表达水平极低，因此该方面研究仍具有巨大的挑战。近10 年来，各种组学技术日新月异，尤其是近年来基因组和转录组学相关研究已从模式植物拟南芥、水稻等成功延伸到各种经济作物。越来越多的已知植物信号肽激素的同源物被发现和鉴定，特别是一些物种特异性和环境适应性的信号肽也得到进一步发掘和鉴定。但是如何验证众多的小分子肽的生物学功能并在生产中充分利用是未来研究的一个重要方向和巨大挑战。植物小肽是一个极具前景的研究领域，但其数量多、生物学功能研究难度大，加上目前植物小分子肽的研究技术手段也还不够成熟，给植物小分子肽的研究增加了难度，但同时也为植物多肽的研究提供了更大的契机。如若将小分子肽成功应用到生产中，就可以减少农药化肥等的施用量，起到减肥增效的效果，还能提高经济作物和粮食作物的产量和品质。