张荣彬 戴志勇 李梦怡 陈振桂 任国谱

(1. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2. 英氏控股集团股份有限公司，湖南 长沙 410005)

维生素A和D是国家标准规定婴幼儿营养米粉中必须添加的维生素，维生素E是可选择添加的维生素。维生素A、D和E分别履行不同的职能，适当的添加维生素有助于婴幼儿的生长发育[1]。维生素A对多种眼科疾病治疗具有积极的作用，可促进眼内色素形成，防止夜盲和视力恶化[2]，对机体的生理具有调节功能，促进身体成长发育、保持代谢平衡和增强免疫力[3]。维生素D对部分矿物质元素吸收具有促进作用，并保持体内钙、磷含量足够。同时，在内分泌系统中，维生素D还参与机体调节和无机盐交换[4]。维生素E俗称生物酚，对生殖器官的正常功能具有维持作用[5]，可降低衰老速度，增强机体耐力，保护细胞组织和预防疾病。而过量摄入维生素A、D和E也会产生副作用，因此监测和控制维生素含量十分重要。

测量不确定度是表征合理的赋予被测量之值的分散性，是与测量结果相联系的参数[6]，不确定度评估在实验室数据比对、方法确认、标准设备校准和数值溯源等方面具有很重要的意义，并且国际上与合格评定相关各方对测量不确定度也十分重视[7-8]。在脂溶性维生素检测方法中，最常用的为光谱法[9]、色谱法[10-11]、化学法和微生物法等，但其存在种种缺点，样品处理复杂、检测时间长、效率低，且不能同时检测和分析多种维生素，随着检测方法的不断发展，高效液相色谱法，提高了分析速度与灵敏度，且可以同时进行多种维生素检测。参照GB 5009.82—2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》、JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》标准，对高效液相色谱法测定幼儿营养米粉中维生素A、D3和E含量不确定度进行分析和评定，旨在提高试验结果的准确性，并为婴幼儿营养米粉的产品质量控制及检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

婴幼儿营养米粉：湖南英氏营养品股份有限公司检验研发中心质控样品。

1.2 试剂

抗坏血酸、BHT、无水乙醇、石油醚、甲醇、正己烷、无水硫酸钠、氢氧化钾：分析纯，广西西陇科学股份有限公司；

维生素A、D3和E标准品：浓度>98%，上海安普实验科技有限公司。

1.3 仪器与设备

超高效液相色谱仪(含二极管阵列检测器和自动进样器)：LC-20AT型，日本岛津公司；

避光恒温水域振荡器：SHA-B型，常州博纳瑞仪器制造有限公司；

旋转蒸发器：RE-52AA型，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.4 方法

1.4.1 样品制备 称取5.000 g样品于150 mL锥形瓶，加入30 mL温水和1 g淀粉酶，60 ℃恒温水浴振荡30 min 后加1.0 g抗坏血酸、0.1 g BHT、30 mL无水乙醇、15 mL氢氧化钾溶液，80 ℃回流皂化30 min后冷至室温，皂化液转入250 mL分液漏斗后加50 mL石油醚萃取5 min，将水相转移至另一250 mL分液漏斗，按上述步骤萃取第2次后合并醚层，水洗至中性。醚层经无水硫酸钠滤入250 mL蒸发瓶，15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次后一同并入，在旋转蒸发器水浴中减压蒸馏至近干后再氮吹至干，用甲醇定容至10 mL容量瓶，0.22 μm有机系滤膜过滤检测维生素A、E。

取5 mL上述溶液于10 mL容量瓶中水浴氮吹至干后加1 mL正己烷，0.22 μm有机系滤膜过滤后进行半制备，净化待测液。将待测液注入液相色谱仪，根据维生素D3标准溶液保留时间收集维生素D3馏分于2 mL容量瓶，水浴氮气吹干后加1.0 mL甲醇溶解，即维生素D3待测液。

1.4.2 维生素A、D3、E标准液配制

(1) 维生素A、D3和E标准储备液配制：准确称取25.0，2.4，65.9 mg的维生素A、D3和E(α-生育酚)标准品，无水乙醇溶解；维生素A和E用50 mL级容量瓶定容，质量浓度为0.500，0.024 mg/mL；维生素D3用100 mL 容量瓶定容，质量浓度为1.318 mg/mL。

(2) 维生素A、D3中间液：分别吸取维生素A和D3标准储备液2 mL与1 mL，分别在10 mL和100 mL容量瓶中用水定容，中间液质量浓度为100 μg/mL和0.24 μg/mL。

(3) 维生素A、D3、E 标准曲线工作液：吸取维生素A中间液和维生素E标准储备液100，200，400，600，800 μL，取10 mL容量瓶加水定容，维生素A工作液质量浓度1，2，4，6，8 μg/mL，维生素E质量浓度13.18，26.36，52.72，79.08，105.44 μg/mL。

吸取维生素D3中间液100，200，400，600，800 μL，取10 mL容量瓶加水定容，得到质量浓度为0.024，0.048，0.096，0.144，0.192 μg/mL标准曲线工作液。

1.4.3 色谱条件 高效液相色谱法测定婴幼儿营养米粉中维生素A、D3和E的色谱条件见表1。

2 模型建立

2.1 数学模型

要计算不确定性，必须首先完善用于计算测量值的数学模型，以便分析其可能的不确定性来源[12]。只有考虑到影响测量值不确定度的主要因素时，整个计算过程中才能接受所得到的各自的相对不确定度值[13]，因此此次试验的维生素A、D3和E模型分别为：

(1)

(2)

(3)

表1 色谱条件

式中：

X——维生素的含量，μg/100 g；

C——标准工作曲线计算得到的维生素浓度，μg/mL；

f——维生素D3浓缩液体积，mL；

V——试样定容体积，mL；

m——试样质量，g；

R——回收率因子。

2.2 不确定度主要来源

参照试验方法并结合试验操作，不确定的来源主要有：① 样品制备过程引入的不确定度UrelYP；② 标准物质引入的不确定度UrelBZ；③ 重复性试验的不确定度UrelCF；④ 回收率引入的相对标准不确定度UrelHS。

3 不确定度分量的评定

3.1 样品制备过程引入的不确定度UrelYP

3.1.1 样品取样引入的不确定度Urelm1依据GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》，样品混匀后随机取样，均匀且具有代表性，忽略其不确定度。

取样量为5.000 g时引入的相对不确定度为：

3.1.3 样品定容引入的不确定度UrelD试样经过处理进行定容，维生素A与E样品定容均采用10 mL容量瓶，维生素D3样品在10 mL容量瓶初步处理后进行半制备，半制备过程中使用1 mL和5 mL移液管，并最终定容在2 mL容量瓶中，结果见表2。

根据表2，样品定容引入的不确定度为：

UrelD-维生素A=UrelD-维生素E=0.001 31。

3.1.4 样品制备引入的相对标准不确定度 样品制备引入的相对标准不确定度公式为：

(4)

综上所述，由式(4)求得：UrelYP-维生素A=0.001 31，UrelYP-维生素D3=0.006 38，UrelYP-维生素E=0.001 31。

3.2 标准物质引入的不确定度UrelBZ

3.2.1 标准储备溶液引入的相对不确定度UrelC

(1) 标准品引入的相对不确定度UrelC1：通过标准证书可知，维生素A、D3、E不确定度分别为1%，1%，2%，均匀分布，K=2，则标准品引入的相对不确定度为：

UrelC1-维生素A=UrelC1-维生素D3=0.005 00；

UrelC1-维生素E=0.010 00。

(2) 标准品称量引入的相对标准不确定度UrelC2：称取维生素A、D3和E标准品，分别为25.0，2.4，65.9 mg，根据3.1.2得知，电子天平US为0.000 057 7 g，根据式(5)求得其相对不确定度分别为：UrelC2-维生素A=0.002 31，UrelC2-维生素D3=0.024 16，UrelC2-维生素E=0.000 88。

(5)

式中：

US——电子天平标准不确定度，g；

m——称取的维生素A、D3和E标准品质量，mg。

(3) 标准储备溶液定容引入的相对标准不确定度UrelC3：维生素A与E标准品均采用50 mL容量瓶，维生素D3标准品需用100 mL容量瓶。样品制备引入的相对标准不确定度公式为：

(6)

根据表3数据并结合式(6)，则标准储备溶液定容引入的相对标准不确定度为：

UrelC3-维生素A=UrelC3-维生素E=0.000 832；

UrelC3-维生素D3=0.000 833。

(4) 标准储备溶液的配制引入的相对标准不确定度：样品制备引入的相对标准不确定度公式为：

(7)

由式(7)求得：

UrelC-维生素A=0.005 70；

UrelC-维生素D3=0.024 69；

UrelC-维生素E=0.010 07。

3.2.2 标准储备溶液稀释引入的相对标准不确定度UrelX

标准储备液进行稀释时，维生素A、D3分别用2 mL 和1 mL移液管，且都需10 mL容量瓶进行定容。根据表4，其稀释引入的不确定度为：

3.2.3 标准工作曲线引入的相对标准不确定度UrelG根据表5数据，计算结果为：

表2 样品定容引入的不确定度†

表3 标准储备溶液定容引入的相对标准不确定度†

表4 稀释引入的不确定度†

表5 标准曲线工作液制备引入的不确定度†

3.2.4 标准曲线引入的相对标准不确定度UrelQ分别配制1，2，4，6，8 μg/mL的维生素A标准溶液，0.024，0.048，0.096，0.144，0.192 μg/mL的维生素D3标准溶液，13.18，26.36，52.72，79.08，105.44 μg/mL的维生素E标准溶液进行测定，每浓度测量两次，采用最小二乘法拟合标准溶液的质量浓度与峰面积曲线，数据见表6。

Sy为回归方程的标准偏差公式：

(8)

不确定度的计算公式：

(9)

表6 校准曲线拟合数据

标准工作液曲线引入的相对标准不确定度：

(10)

式中：

Ai——标准工作曲线斜率；

B——标准工作曲线截距；

n——标准工作液的测试次数，n=10；

yi——不同浓度对应的峰的峰面积；

P——测试次数，P=2；

根据表6，标准工作液曲线引入的相对标准不确定度为：UrelQ-维生素A=0.010 76，UrelQ-维生素D3=0.014 93，UrelQ-维生素E=0.004 24。

综上所述，则标准物质引入的不确定度为：

3.3 重复性试验的不确定度UrelCF

称取同一批次的婴幼儿米粉，进行6次平行试验，同时进行前处理，在相同的高效液相色谱条件下平行测定定容后试样液中维生素A、D3和E的浓度，呈正态分布，采用极差法，结果见表7。

单次试验测量的标准偏差公式为：

(11)

两次测定婴幼儿营养米中维生素A、D3、E含量的平均值的相对标准不确定度公式为：

(12)

根据表7计算重复性试验的不确定度为：UrelCF-维生素A=0.003 84，UrelCF-维生素D3=0.021 70，UrelCF-维生素E=0.005 15。

3.4 回收率引入的相对标准不确定度UrelHS

准确称取约5.000 g婴幼儿营养米粉固体，加入维生素A、D3和E各3个浓度梯度进行回收率的测定。但由于试样酶解不完全、皂化不完全，石油醚萃取和蒸馏浓缩操作不当、基质的干扰等，导致维生素A、D3和E的损失，则婴幼儿米粉中维生素A、D3和E不能100%的进入测定中。本底样品6次数据见表8。

表7 试验数据及分析结果

表8 本底样品6次数据

表9 维生素A加标回收率数据

表10 维生素D3加标回收率数据

表11 维生素E加标回收率数据

则：UrelHS-维生素A=0.009 90;UrelHS-维生素A=0.012 70;UrelHS-维生素E=0.007 47。

为了判断是否引进回收率校正因子R，在实际计算时，需要对回收率进行显著性分析[15]。

将数据代入式(13)，则T维生素A=6.891 9；T维生素D3=9.552 9；T维生素E=5.791 9，根据t检验临界值分布表，当自由度f=4时，查t临界值分布表[16]，t(0.05，4)=2.776 0。根据试验结果，T维生素D3>T维生素A>T维生素E>2.776，因此计算需要引入校正因子。

(13)

3.5 合成标准不确定度

合成标准不确定度计算公式如式(14)所示。

(14)

根据式(14)且结合数据，合成标准标准不确定度计算结果如表12所示。

3.6 扩展不确定度

在置信概率95%时，K=2，则扩展不确定度为：

表12 各相对标准不确定度

3.7 测量不确定度报告

高效液相色谱仪同时对婴幼儿营养米粉中维生素A、D3和E含量进行测定，结果为：

X维生素A=(9.250 0±0.188 4) μg/g(K=2)；

X维生素D3=(0.114 0±0.009 3) μg/g(K=2)；

X维生素E=(0.1815±0.006 7) μg/g(K=2)。

4 结论

采用高效液相色谱法同时对婴幼儿营养米粉中维生素A、D3和E进行测定，当取样量为5.000 g时，样品中维生素A、D3和E扩展不确定度为0.188 4，0.009 3，0.006 7 μg/g，测定含量为(9.250 0±0.188 4)，(0.114 0±0.009 3)，(0.181 5±0.006 7) μg/g。

结合试验过程及计算结果可知，婴幼儿米粉中维生素A、D3和E的最终结果的不确定度主要是由标准溶液储备液配制、标准工作曲线拟合和回收率引起的。因此，选择最佳试验条件、采用高精密度仪器、定期维护及保养设备、改善试验方法和规范试验操作对提高试验结果的准确性至关重要。