刘春雷，刘燕琴，陈艾萌，曹 敏，唐祥友，胡开治

（1.重庆市药物种植研究所，重庆南川 408435；2.四川省内江市农业科学院，四川内江 641000）

栀子为临床中常用的清热利湿、凉血解毒中药，来自茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。栀子的主要活性成分包括环烯醚萜苷类、二萜类、三萜类、有机酸酯类及黄酮类等［1-5］，具有保肝利胆［6］、调节血糖［7］、抗炎［8］、抗氧化［9］等作用。栀子苷属环烯醚萜苷类，为栀子的指标成分，同时也是主要的药效成分，其含量的高低直接影响着药材的品质。

西红花苷又称藏红花素，是名贵中药藏红花的主要有效成分，现代研究表明，西红花苷具有抗肿瘤［10］、治疗心血管疾病［11］、改善记忆力［12］、抗抑郁［13］等作用，具有极高的药用和经济价值，主要来源于藏红花花朵中的3 个柱头，其产量极低、珍稀难求，被称为药材中的“红色黄金”。栀子是少数能够合成西红花苷的植物之一，并且资源丰富、产量高，因此探索栀子中西红花苷的累积规律及提取工艺成为了近年来的研究热点。相关学者以杂合的栀子栽培群体或市场购买样品作为供试材料，开展了相关累积规律研究［14-17］，发现不同时期栀子果实中栀子苷、西红花苷含量存在较大差异［18-19］。中药材的活性成分通常为次级代谢产物，其合成积累受到多种因子综合的影响，其中遗传因素最为重要，研究表明，不同种质栀子果实的栀子苷、西红花苷含量存在较大差异［20-21］，但不同栀子品系的栀子苷、西红花苷累积规律是否一致目前尚未见报道，在大力推进中药材良种应用的时期，本研究以渝栀1 号、渝栀2 号、4-1 号栀子品系为对象，采用HPLC 法测定不同采收期果实中的栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的含量，以期为分类和定向需求采收栀子提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集 试验材料为项目组前期审定及选育的渝栀1 号、渝栀2 号、4-1 号栀子无性系，于2016 年3 月下旬，选取长势一致的一年生扦插苗，种植于重庆市南川区重庆市药物种植研究所栀子基地，经纬度为 E107.21588°，N29.134555°，海拔590 m，试验点为肥力适中的砂壤土，采用耕地机松土、整平。按照株行距1.3 m×1.7 m，分别种植约100 m2，采用同一方法管理，每年人工除草2 次，均不喷洒农药和施用肥料，以减少人为干涉。

样品采集，于2018 年7 月23 日起，每隔20 d取样，每个品系随机选取5 株，每株摘取8 个果实进行混合，重复3 次。将采集的栀子果实样品，置沸水中略烫后，置于40 ℃烘箱中烘干，粉碎，过4 号筛后备用。

所用乙腈和甲醇分别为色谱纯、分析纯，均为成都市科龙化工试剂厂生产。对照品栀子苷（批号PS010461，纯度99.6%），购自成都普思生物科技股份有限公司；西红花苷Ⅰ（批号111588-201704，纯度88.4%）、西红花苷Ⅱ（批号11589-201705，纯度92.2%），均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 方法学考察及样品测定

1.2.1 色谱条件 迪马Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0 min，15%A；10 min，20%A；15 min，25%A；25 min，40% A；30 min，15% A；35 min，15%A）；体积流量1 mL／min；进样量10 μL；柱温30 ℃；检测波长栀子苷238 nm，西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ440 nm。

1.2.2 对照品及供试品溶液制备 精密称定适量的栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ对照品，制备成质量浓度分别为0.75、0.5、0.5 mg／mL 的贮备液，然后分别取适量的对照品贮备液，稀释成栀子苷质量浓度分别为 30、90、150、210、270、330 μg／mL；西红花苷Ⅰ质量浓度分别为4、12、20、28、36、44 μg／mL；西红花苷Ⅱ质量浓度分别为2、6、10、14、18、22 μg／mL 的混合对照品溶液。

称取栀子粉末0.1 g，加入30 mL 甲醇，超声30 min，冷却后，用甲醇溶液定容至50 mL，滤过，即得供试品溶液。

1.2.3 线性关系考察 分别精密吸取不同质量浓度的混合对照品溶液10 μL，在“1.2.1”项条件下测定，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），进行回归，得栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的回归方程分别为Y＝1 393 826.904 1 X-424 051.082 2（r＝0.998 1）；Y ＝6 427 572.142 9 X+6 713.019 0（r＝0.999 8）；Y＝7 517 001.428 6 X-13 160.171 4（r＝0.999 6）。表明栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ分别在30～330、4～44、2～22 μg／mL范围内线性关系良好。色谱图见图1。

1.2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，在“1.2.1”项条件下连续进样6 次，记录峰面积。测得栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ峰面积RSD 分别为0.96%、1.18%、0.74%，表明仪器精密度良好。

1.2.5 重复性试验 精密称取同一栀子样品5 份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别吸取10 μL，在“1.2.1”项条件下进样。测得5 份样品栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的平均含量分别为 5.22%、1.35%、0.25%，RSD 分别为1.54%、1.38%、0.92%。表明该方法重复性良好。

1.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在“1.2.1”项条件下，分别于2、4、8、16、24、48 h进样，测得栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量RSD 分别为0.58%、1.10%、1.74%。结果表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

1.2.7 加样回收率试验 精确称取已知栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量的栀子样品0.05 g，共6 份。根据其含量，分别等量加入栀子苷对照品3.210 5 mg、西红花苷Ⅰ对照品0.665 5 mg、西红花苷Ⅱ对照品0.113 mg，在“1.2.1”项条件下进样。测得栀子苷、西红花苷、西红花苷Ⅱ的平均回收率分别为98.72%、97.31%、98.11%，RSD 分别为1.21%、1.04%、1.47%。

1.2.8 样品含量测定 取各供试栀子样品，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.1”项条件下进样10 μL，测定峰面积，计算含量。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.3 数据处理 采用SPSS 19.0 软件对结果数据进行方差分析及多重比较，利用GraphPad Prism 6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同时期栀子苷含量变化 3 个栀子品系不同生长期的栀子苷含量见表1。结果显示，不同生长期间，栀子苷含量具有显著差异。在生长前期（T1～T5），3 个栀子品系的栀子苷含量均呈下降趋势。T1 时期渝栀1 号、渝栀2 号、4-1 号的栀子苷含量平均约为T8 时期的2 倍。

由图2 可知，在栀子果实成熟后期，不同品种间的变化规律略有不同，渝栀1 号的栀子苷含量于T6 时期降至最低后，略微增加，但T6、T7、T8 3个时期的栀子苷含量差异不显著。而渝栀2 号和4-1 号的栀子苷含量分别在T5、T6 时期降至较低水平，略微增高后，在T8 时期显著降低。

2.2 不同生长期样品中西红花苷I、西红花苷Ⅱ的含量变化 由表2 可知，不同生长期间，西红花苷I、西红花苷Ⅱ含量均有显著差异。随着果实的成熟，3 个栀子种质的西红花苷I、西红花苷Ⅱ的含量均逐渐增加，并在T8 时期达到最高峰。其中，4-1 号栀子的西红花苷I 含量最高，分别为渝栀1号、渝栀2 号的1.14、1.7 倍；渝栀1 号的西红花苷Ⅱ含量最高，较渝栀2 号、4-1 号分别高78.3%、11.1%。

表1 不同生长期样品中栀子苷含量（，%，n＝3）Tab.1 Contents of gardenoside in samples at different growth stages（，%，n＝3）

表1 不同生长期样品中栀子苷含量（，%，n＝3）Tab.1 Contents of gardenoside in samples at different growth stages（，%，n＝3）

注：同列数据后小写字母不同者表示差异显著，大写字母不同者表示差异极显著。

图2 不同生长期样品中栀子苷含量变化趋势Fig.2 Trend of gardenoside content variations in samples at different growth stages

不同栀子品系的西红花苷总量变化趋势显示，8 月份（T2）至10 月份（T6），是栀子西红花苷的快速积累期，10 月之后趋于平缓。见图3。

图3 不同生长期样品中西红花苷总量含量变化趋势Fig.3 Trend of total crocin amount variations in samples at different growth stages

表2 不同时期样品中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量（，%，n＝3）Tab.2 Contents of crocin Ⅰand crocin Ⅱin samples at different growth stages（，%，n＝3）

表2 不同时期样品中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量（，%，n＝3）Tab.2 Contents of crocin Ⅰand crocin Ⅱin samples at different growth stages（，%，n＝3）

注：同列数据后小写字母不同者表示差异显著，大写字母不同者表示差异极显著。

3 讨论

药用植物更加注重质量，品质的高低则与其活性成分的含量直接相关。研究表明栀子苷于栀子花期结束后8 周（7、8 月份）左右，其含量增加至最高［22］，然后逐步降低，中、晚期果又缓慢增加，最后达到一个平衡值［18］。本研究中，随着果实成熟，栀子苷的含量在生长前期呈逐渐降低的趋势，成熟果实中栀子苷含量仅约为8 月份幼果的50%，这与前人研究结果一致［18，20］。但在成熟后期，不同品系间，具有一定差异，渝栀2 号、4-1 号的栀子苷含量分别在10 月上旬、10 月末降至较低水平，略微增加后，再次显著降低，而渝栀1 号最后3 个时期的栀子苷含量差异不显著，较为稳定。这可能与不同栀子品种的成熟度有关，渝栀1 号为晚熟品种，其果实成熟期为12 月中旬，渝栀2 号和4-1 号均为早熟品种，成熟期为11 月中下旬，表明栀子果实过度成熟会造成栀子苷进一步降解。

西红花苷也为栀子的主要活性成分之一，影响着栀子的品质。刘和平等［18］对水栀子进行研究发现西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ均随着果实的生长逐渐升高，并在成熟末期（12 月初）达到最高，而陈阳等［23］对采集于泸州的栀子样品分析结果显示，西红花苷的含量于11 月中旬达到最高为1.32%，随后趋于下降。在本研究中，渝栀1 号、渝栀2号、4-1 号栀子的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量均随着果实的生长，在8 月到10 月间快速积累，然后缓慢增加，这与文献［18］的研究结果一致。

中药材是由多种活性成分构成的复杂体系，因此单以指标成分含量测定结果，并不能全面、准确地反映药材质量的优劣［24-25］，以栀子苷、西红花苷作为评价指标，渝栀1 号的适宜的收获期为12月上旬，而渝栀2 号和4-1 号应11 月中旬，这与其栀子果实的成熟期也较为一致。

本研究探讨了3 个栀子品系的栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的累积规律，结果表明，不同栀子品系间，3 种活性成分含量及栀子苷的累积规律具有一定差异，并根据栀子苷及西红花苷的变化规律，确定了渝栀1 号、渝栀2 号、4-1 号栀子适宜的采收期，以期为栀子的良种选育及规范化生产提供参考。