寿斌耀 ，陈兰英∗ ，张 妮，谢欣序，罗颖颖，邵 峰，刘荣华

（1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西南昌 330006；2.江西中医药大学药学院，江西南昌 330004）

降香Dalbergia odorifera T.Chen，为豆科植物降香檀树干和根的干燥心材，具有行气止痛、化瘀止血的功效［1］。其成分复杂，主要含有挥发油、黄酮类。现代研究表明降香具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等多种作用［2］。临床上降香被广泛用于心血管疾病的治疗。然而，降香在心血管方面的作用及机制仍不明确。本研究以降香中医功效行气止痛为起点，探索降香的药理作用与机制。行气是指进入心脏的气（氧气和水谷精微），产生ATP，进而维持心肌正常结构与功能［3］，其与能量代谢密切相关。同时研究报道指出降香油（volatile oil of D.odorifera，DOO）、降香水提物（aqueous extract of D.odorifera，DOA）具有调节心脏正常能量代谢的作用［4］。基于此，为进一步研究降香水提物与降香油对心脏的影响，实验构建异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血模型，探究降香水提物和降香油对缺血大鼠心脏能量代谢的影响及可能机制，以期为降香的临床使用提供实验数据和指导。

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。

1.2 试剂与药物 实验用降香药材购于广西玉林东盟药材市场，由广西大学林产品质量检测中心检测鉴定。降香水提物（自制）和降香油（自制），均由江西中医药大学药学院刘荣华教授团队提供。降香水提物的制备（降香药材阴干粉碎后1 kg，加10 L 水提取1 h，滤过。滤渣用8 L 水再提取1 h，滤过，合并滤液，浓缩干燥，得到干浸膏，得干浸膏93.8 g，得膏率9.38%）。降香油的制备（降香药材1 kg，水蒸气蒸馏法回流提取6 h。收集馏出液，通过分液处理得到油性成分，得到降香油21.5 g，得油率2.15%）；异丙肾上腺素（批号WXBB7695V，美国Sigma 公司）；盐酸普萘洛尔片（批号E180913，江苏亚邦爱普森药业有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（批号 R1 AR796，R2 AP318）、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒（批号R1 AR792，R2 TG862），均购于日本和光纯药株式会社；肌酸激酶同工酶MB（CKMB）测定试剂盒（批号18111001，北京利德曼生化股份有限公司）；苏木精及伊红染液（批号517-28-2，美国Sigma 公司）；三磷酸腺苷二钠（批号140674-201502）、一磷酸腺苷钠（批号140719-200501）、二磷酸腺苷二钠（批号140809-201501），均购自于中国食品药品检定研究院；逆转录试剂盒（批号K1622）、SYBR Green mix 试剂盒（批号4472908），均购于美国Thermo Fisher 公司。

1.3 仪器 Centrifuge5810R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；ABI750 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；ML204E 分析天平（瑞士Mettler Tiledo 公司）；亚光YB-6LF 型生物组织石蜡包埋机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）；日立7100全自动生化分析仪（日本日立公司）；常压高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ML866 型Powerlab 电生理记录仪（澳大利亚ADI Instruments 公司）；RM2016 型轮转式切片机（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 动物造模及给药 取健康大鼠70 只，适应环境后按体质重随机分成7 组，分别为正常组（给予等容量蒸馏水），模型组（给予等容量蒸馏水），普萘洛尔（30 mg／kg），降香水提物高剂量组（320 mg／kg）、降香水提物低剂量组（160 mg／kg），降香油高剂量组（72 mg／kg）、降香油低剂量组（36 mg／kg）。连续灌胃给药5 d。根据文献［5］方法以及实验室前期对造模剂量的摸索，第4 天、第5 天，灌胃给药30 min 后，除正常组外，其余各组皮下注射异丙肾上腺素30 mg／kg，每天1 次，连续注射2 d，复制急性心肌缺血模型。正常组皮下注射等体积的生理盐水。实验期间自由进水，进食。

2.2 大鼠心电图测定 末次给药40 min 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧固定，Powerlab电生理记录仪记录Ⅱ导联心电图10 min。在皮下注射异丙肾上腺素或者生理盐水后继续观察30 min，比较各组大鼠造模前后的ST 段差值。

2.3 大鼠血压的测定 心电图检测完毕后，自大鼠颈部正中切开，促使大鼠左颈总动脉充分暴露，并对其进行钝性分离，将颈总动脉远心端结扎，近心端用动脉夹夹住，将准备好的颈动脉插管向近心端插入，用近心端的穿线结扎动脉血管和导管，即可看到动脉的血压波形，等动物稳定后，就开始实验内容。测得收缩压、舒张压、平均动脉压。

2.4 血清心肌酶LDH、CK-MB、AST 检测 血压检测后，每只大鼠立即腹主动脉采血，室温静置1 h后低温高速离心机以3 500 r／min 离心10 min，分离血清。全自动生化分析仪检测血清LDH、CKMB、AST 水平。

2.5 心肌组织病理学观察 取心脏组织，10%甲醛固定24 h 以上，然后进行常规石蜡包埋，切片（5 μm），HE 染色，封片最后在光学显微镜下观察心肌组织病理变化。

2.6 HPLC 检测心脏组织高能磷酸化合物含量按照文献方法对心脏组织进行处理［6］，制备样本。ODSHYPERSILC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25 ℃；流动相50 mmol／L 的磷酸钾缓冲液（pH 6.5）；体积流量1 mL／min；紫外检测波长254 nm；进样量10 μL。根据以上检测条件，测定心肌组织中ATP、ADP 和AMP 含量，其中总腺苷酸量TAN＝ATP+ADP+AMP；心肌细胞能荷EC ＝（ATP+1／2ADP）／TAN。

2.7 RT-PCR 法检测心脏组织AMPK 相关基因的表达 取心脏组织按照trizol 试剂盒说明书提取RNA，测定RNA 的浓度，在总体积20 μL 的条件下逆转录RNA 得到cDNA。进行Real-time PCR。引物序列为VEGF（正向：CGGTGTGGTCTTTCGTCCTTC，反向：GGTTTGTCGTGTTTCTGGAAGTG ）；ENOS（正 向：GATGGCTGAACGAAGATTGC，反向：TATTTGATGCTCGGGACTGC）；β-actin（正向：ACAGTGGAGAACTGTGAGCA，反向：CTGCTCCCGGTTAGAGTAGG ）；AMPK（正向：TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT，反向：GGTGAGCCACAACTTGTTCTT）；CPT1（正向：TATGGTCAAGGTCCTCTCAGGT，反向：GAAGACGAATGGGTTTGAGTTC）；GLUT4（正向：ACTCAGGGCTAACATCAGGGT，反向：CTCAGGACAGAAGGGCAACAG）；PFKFB3（正向：AGCTGACTCGCTACCTCAAC，反向：GCCCACCATGACGATGACGG）；PKM2（正向：TTCCTGCCTCTTGGTATGAC，反向：CGGCTTGTTCCCTCCTAC）；PDH（正向：CCATCTCATCACTGCCTATCG，反向：AGCCTCCTCTTCGTCCTGTTA）；PI3K（正向：AACGACAAGCAGAAGT，反 向：CGAGGACAGCAACAT）。反应条件按照ThermoFisher Real-time PCR 试剂盒。基因表达计算由2-△△CT表示。

2.8 统计学处理 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比采用LSD 法。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对急性心肌缺血大鼠心电图的影响 实验结果发现，与对照组比较，模型组ST 段变化值和心率升高（P ＜0.01），显示心肌缺血；与模型组比较，降香各提取物组与普萘洛尔能显著ST 段变化值（P＜0.01，P＜0.05）；降香油组能降低大鼠心率（P＜0.01）。见表1。

表1 降香水提取和降香油对急性心肌缺血大鼠心电图ST段变化值与心率的影响（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

表1 降香水提取和降香油对急性心肌缺血大鼠心电图ST段变化值与心率的影响（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

注：与正常组比较，∗∗P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 对急性心肌大鼠血压的影响 研究结果发现，模型组大鼠的收缩压、舒张压均低于正常大鼠的收缩压、舒张压（P＜0.01）。给予降香油处理，大鼠收缩压、舒张压对比模型组有所恢复；普萘洛尔组和降香水提物组，大鼠收缩压、舒张压对比模型组无差异。见表2。

表2 降香水提物和降香油对急性心肌缺血大鼠收缩压、舒张压和平均动脉压的影响（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

表2 降香水提物和降香油对急性心肌缺血大鼠收缩压、舒张压和平均动脉压的影响（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.3 对血清LDH、CK-MB、AST 水平的影响 实验结果发现，与正常对照组比较，模型组大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，除了降香水提物低剂量组外其余各组都能降低血清LDH、CK-MB、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01）；降香水提物低剂量组能降低血清CK-MB、AST 水平（P＜0.05）。见表3。

3.4 对组织病理学的影响 HE 染色结果显示，正常组大鼠心肌纤维排列整齐，细胞核形态正常，未出现炎性细胞浸润等情况。模型组大鼠心肌损伤明显、心肌纤维断裂、排列紊乱、空泡化明显、炎性细胞浸润。普萘洛尔组心肌纤维排列整齐，细胞间质内可见炎性细胞浸润。降香油高剂量组与降香油低剂量组大鼠心肌纤维轻度排列紊乱，局部少量炎性细胞浸润。降香水提物高剂量组大鼠心肌纤维中度紊乱，轻中度空泡样变性，轻度水肿，间质少量炎性细胞浸润。降香水提物低剂量组大鼠心肌纤维断裂，细胞空泡变性明显，间质有明显炎性细胞浸润。见图1。

表3 降香水提物和降香油对急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影响（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

表3 降香水提物和降香油对急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影响（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 对心脏组织高能磷酸化合物及能荷的影响 在本实验中，ATP、ADP、AMP 在10 min 内达到基线分离，保留时间为3.259、3.510、4.314 min。见图2。与正常组比较，模型组心肌组织高能磷酸化合物含量和细胞能荷EC 水平下降（P＜0.01）；与模型组比较，普萘洛尔组能够明显改善心肌能量代谢，心肌组织ATP 含量和能荷EC 水平提升（P＜0.01）。降香水提物和降香油各组在ATP、ADP、AMP 水平没有明显改善，在能荷EC 水平上提升（P＜0.01）。见表4。

图2 心肌提取液样本与ATP、ADP、AMP 标准品色谱图Fig.2 Chromatograms of myocardial extract samples and ATP，ADP，AMP standards

表4 降香水提物和降香油对心脏组织ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影响（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

表4 降香水提物和降香油对心脏组织ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影响（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 对心脏组织VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 水平的影响 与正常组比较，模型组AMPK、 CPT1、PI3K、 VEGF mRNA 表达降低（P ＜0.05，P ＜0.01），PFKFB3、 PKM2 mRNA 表达上升高（P ＜0.01），ENOS mRNA 表达有降低趋势；与模型组比较，降香水提物各组PFKFB3、 PKM2 mRNA 表达降低（P＜0.01），PI3K、 ENOS、 VEGF mRNA 表达升高（P＜0.01），高低剂量组存在量效关系。降香油各组AMPK、 CPT1mRNA 显著升高（P ＜0.01），高剂量组表达更显著。见图3。

4 讨论

图3 降香水提物和降香油对VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、 GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 表达的影响Fig.3 Effects of DOA and DOO on VEGF，ENOS，CPT1，AMPK，GLUT4，PFKFB3，PKM2，PDH，PI3K mRNA expressions

脂质代谢、糖代谢是心肌细胞维持正常能量代谢的主要途径。其中脂肪酸是心脏的主要能量来源，约60%～70%的三磷酸腺苷（ATP）是由脂肪酸通过脂肪酸β 氧化产生。在整个脂肪酸β 氧化中脂酰CoA 进入线粒体是脂肪酸氧化的限速步骤，CPT-1 蛋白位于线粒体外膜是脂肪酸氧化的限速酶［7-8］。葡萄糖是心脏代谢的另一种重要底物，葡萄糖代谢是一种高效率的能量代谢方式。通过糖酵解产生丙酮酸，丙酮酸进入线粒体后在丙酮酸脱氢酶（PDH）的作用下不可逆的转化为乙酰CoA 和NADH，PDH 是葡萄糖氧化过程中的关键酶。心肌缺血，心肌细胞氧气供应减少，能量代谢改变，主要表现为脂肪酸与葡萄糖氧化的变化［9］。本实验结果表明异丙肾上腺素造模后，模型组心脏组织ATP、ADP、AMP 整体下降，心肌细胞能量状态EC 水平明显降低。普萘洛尔组心脏组织ATP 含量较模型组显著上升，心肌细胞能量状态EC 水平明显提升。降香水提物与降香油组ATP、ADP、AMP、TAN 与模型组比较并无差异，但是心肌细胞能荷EC 水平却明显升高，表明了降香水提物与降香油能够在低能量水平维持正常的心肌细胞能荷EC。另外，实验数据也表示降香水提物组能够抑制葡萄糖有氧代谢的关键酶PDH 的表达，增强VEGF、 PI3K、 ENOS 基因的表达；VEGF 是多方位影响血管内皮细胞的生产因子，其介导血管新生是微细血管增殖、新生血管形成的关键因素［10］。降香油能够增强AMPK 基因的表达。腺苷酸激活蛋白激酶AMPK 是CPT1 的正向基因，能够调节多种脂质代谢相关酶及转录因子，在维持脂质代谢稳态中发挥着极其重要的作用［11］。实验表明降香水提物和降香油能够调节脂肪酸氧化与糖代谢，维持心肌细胞能量代谢的平衡，从而起到保护心肌的作用。

在本研究中，课题组发现降香抑制糖代谢，增强脂肪酸氧化调控心肌能量代谢平衡，保护心脏的作用这一机制与市场上的一些药物如曲美他嗪、哌克昔林通过抑制脂肪酸氧化，增强糖代谢发挥心肌保护作用的机制相反；与正常心脏能量代谢中脂肪酸氧化占比高于糖代谢这一情况相同。分析其可能原因为强糖代谢、抑制脂肪酸氧化，能够用更少的氧气提供更多的能量［12］，能够缓解心肌缺血心脏能量供需不平。而增强脂肪酸氧化、抑制糖代谢，更有利于维持心脏的正常能量代谢，在治疗心绞痛，预防心肌缺血上发挥更大的作用。

实验研究结果显示降香水提物和降香油对异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心肌缺血模型具有保护作用，可以明显降低心电图ST 段变化，降低血清心肌酶CK-MB、LDH 及AST 的水平，减轻心肌组织形态结构的损伤。进一步的机制研究结果显示，降香油主要是通过上调AMPK、CPT1 增强脂肪酸氧化维持能量代谢平衡，降香水提物主要通过抑制PKM2、PFKFB3 抑制糖酵解途径来维持能量代谢平衡。