赵守香 郭琴 李颖 王涛 田胜南 蔡晓珊

目前肺癌在全球癌症发病率中位居第一，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）国际癌症研究署发布的癌症报告显示，2018 年全球肺癌新发病例约有209 万例，死亡患者约176 万例，分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的11.6%和18.4%，居恶性肿瘤第1 位，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占80%～85%［1］。当前治疗肺癌的主要措施除了手术、放疗、化疗，还有靶向治疗和免疫治疗。随着酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）靶向药物治疗在NSCLC患者中广泛应用，其无进展生存期（progression-free survival，PFS）较单纯化疗明显延长，但到目前为止，尚无针对KRAS 基因突变靶点的有效药物广泛应用于国内临床，所以对KRAS 基因突变的NSCLC 患者的治疗方案仍是一个悬而未解的问题［2］。本研究收集2018 年9 月—2020 年9 月453 例NSCLC 患者的临床资料，总结并分析是否存在KRAS 基因突变患者的临床病理特征，旨在深入了解KRAS 基因突变，从而指导临床进行个体化治疗，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择潍坊市第二人民医院2018 年9 月—2020 年9 月进行手术切除、纤维支气管镜和穿刺活检经病理确诊且资料完整的453 例原发性NSCLC 患者作为研究对象。标本经10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋、切片以及苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，并确定肿瘤细胞数量足够，再进行后续试验。分类整理所有患者的临床资料，包括一般情况（性别、年龄、吸烟史）和临床病理资料（包括病理组织学类型、临床分期、淋巴结转移情况）。

1.2 试剂与仪器 石蜡切片组织基因组DNA 提取试剂盒、5 种突变基因检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司；SLAN-96S 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（购自上海宏石医疗科技有限公司），Eppendorf 微量紫外分光光度计。

1.3 检测方法

1.3.1 石蜡切片标本组织的基因组DNA 提取 评估肿瘤细胞含量后，使用一次性切片刀切取4～12片组织切片，置于洁净的1.5 mL 离心管中，按照DNA提取试剂盒说明书示范操作进行DNA 抽提。使用Eppendorf SMA4000 微量紫外分光光度计测定DNA的纯度及含量。

1.3.2 KRAS 基因突变检测 采用突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）扩增KRAS 基因的12 和13 密码子。操作方法依据试剂盒说明书，反应循环参数为：42 ℃ 5 min；95 ℃5 min，1 个循环；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10 个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36 个循环。反应结束后，由荧光定量PCR 仪输出扩增曲线，根据试剂盒说明书中的判读原则来确定突变。每次ARMS 分析实验均设置阳性及阴性对照，以保证结果的准确性。

1.4 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理审批（审批号：20201225），所有检测均获得过患者或家属的知情同意。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析和处理，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验比较KRAS 基因突变及其各突变类型NSCLC 患者的临床病理特征。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者肿瘤组织KRAS 基因突变情况在453 例接受5 种基因突变检测的NSCLC 患者中，检出KRAS 基因突变50 例，总突变率为11.04%。该试剂盒检测出两种突变类型，分别为G12D/S 型突变6 例，突变率为1.32%，以及G12A/V/R/C、G13C 型突变44 例，突变率为9.71%。见表1。

表1 453 例NSCLC 患者肿瘤组织KRAS 基因突变情况

2.2 不同临床病理特征NSCLC 患者的KRAS 基因突变情况比较 男性、腺癌、有吸烟史的NSCLC 患者更易发生KRAS 基因突变，其突变率明显高于女性、其他类型癌症以及无吸烟史的NSCLC 患者（均P＜0.05）。虽然KRAS 基因突变率在不同年龄、临床分期以及有无淋巴结转移的NSCLC 患者中不同，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征453 例NSCLC 患者的KRAS 基因突变情况

2.3 不同临床病理特征NSCLC 患者KRAS 基因的突变类型分布 试剂盒检测出的KRAS 基因两种突变类型在不同性别、年龄、病理类型、临床分期、有无吸烟史以及有无淋巴结转移的NSCLC 患者中比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 不同临床病理特征50 例NSCLC 患者的KRAS 基因突变分型分布

3 讨论

KRAS 是NSCLC 患者中常见的突变癌基因之一，已知参与肺癌发生以及肿瘤生长、转移和扩散等多个过程［3］。NSCLC 患者中约有20%～30%存在KRAS 基因突变，在大多数情况下，KRAS 基因突变是由于外显子2、密码子12 和13 的错义突变，但也存在更罕见的等位基因突变［4］。KRAS 基因与大鼠V-Ha-Ras Harvey 肉瘤病毒癌基因和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因一起编码一个膜结合的相对分子质量为21 000 的鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白家族，该家族通过与多种效应物的相互作用来调节细胞生长、分化和凋亡，这些效应物包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、信号转导和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）以及磷酸肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）信号通路［5］。

KRAS 基因在欧美国家NSCLC 患者中的突变频率较高，在肺腺癌患者中突变率可达到30%～50%，但亚洲地区的KRAS 基因突变率低于欧美地区，约为10%［6-7］。KRAS 基因突变与患者的临床病理特征、肿瘤组织学、种族差异以及有无吸烟史有一定相关性［8］。KRAS 基因突变常发生在肺腺癌患者中（突变率约为30%），而在鳞状细胞癌患者中较少见（突变率约为5%）［9］；且该突变与吸烟习惯存在明显相关性［5］。本研究中NSCLC 患者的KRAS 基因突变率为11.04%，且该突变较易发生于有吸烟史的男性患者中，这与文献报道一致［10］。本研究结果还显示，KRAS 基因中G12D/S 型和G12A/V/R/C、G13C 型这两种突变类型在不同性别、年龄、临床分期、病理类型、有无吸烟史以及有无淋巴结转移的NSCLC 患者中存在差异，但无统计学意义。由于本研究中KRAS 基因突变病例数较少，它们之间是否具有相关性还需进一步的研究。

据文献报道，KRAS 基因不同突变亚型的生物学功能不同，可能与鸟苷三磷酸酶（GTPase）活性存在差异有关［11］，这就为探讨KRAS 基因不同突变亚型与预后之间的关系提出了必要性，但关于这方面的研究结果在既往文献报道中并不一致。Cai 等［12］研究表明，存在KRAS 基因G12D 型突变的患者PFS和总生存期（overall survival，OS）均比KRAS 基因G12C 型突变和G12V 型突变的患者短。随着对KRAS 突变型NSCLC 的研究，越来越多的文献表明，KRAS 基因突变型NSCLC 实际上是一种异质性疾病，可能由共同发生改变的染色体定义的分子亚群导致。在某些情况下同时发生的基因突变似乎在不同程度上调控了细胞内的生理过程，并影响肿瘤在其微环境中的行为［13-15］。因此，在一项回顾性分析中，研究者分析了NSCLC 患者中常见的KRAS 基因突变亚型和同时并发其他致病性基因突变对患者OS 的影响以及这些基因突变如何影响肿瘤PD-L1的表达，结果表明，KRAS 基因G12D 和STK11 共突变与患者预后不良有关［16］。KRAS 基因G12C 和TP53 共突变与PD-L1 阳性表达相关，预示着对此种突变型患者应用抗PD-1/PD-L1 免疫治疗可能有效。

目前KRAS 基因突变NSCLC 患者的常用治疗方法仍为含铂双药化疗，患者的预后相对较差。汤伟忠等［17］采用岩舒复方苦参注射液联合紫杉醇+顺铂化疗方案治疗NSCLC 取得良好疗效。另一方面有研究表明，对KRAS 基因突变的NSCLC 患者应用吉非替尼靶向治疗，效果并不显著，且存在天然耐药趋势［18］。该如何治疗此类患者的问题一直困扰着临床医生。近年来，一些针对G12C 型突变抑制剂的研究逐渐成为靶向治疗KRAS 基因突变NSCLC的主流方向。前期临床实验结果显示，AMG510 小分子抑制剂在KRAS 基因G12C 型突变的晚期肺癌患者中显示出有潜力的疗效以及可控的安全性［19］，期待后续的相关临床研究结果。另外，近年来免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）作为一种挽救性治疗方法改善了KRAS 基因突变的晚期NSCLC 患者总生存期，这一结果表明KRAS 基因突变状态可能是ICIs 提高生存率的潜在生物标志物［20］。这是否预示着KRAS 基因突变肺癌患者能从单一的含铂双药化疗进入一个靶向治疗及免疫治疗的全新时代，有待进一步的研究。

综上所述，对KRAS 基因突变NSCLC 患者的准确临床管理对改善该类患者预后有重要意义。关注此类患者的KRAS 基因突变情况，并制定精准的个体化治疗方案，可以实现疗效的最大化，提高患者的生活质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突