李孟兰 林 宁 石 慧 王丽娟 姜志欣 黄丽丽 吴玉璘

江苏省计划生育科学技术研究所实验筛检中心 江苏省生殖健康检验中心，江苏南京 210036

耳聋是我国常见的一种感觉神经系统缺陷性疾病，严重影响着患者本人及家庭人员的生活质量。耳聋是由遗传因素、环境因素或遗传与环境因素交互作用引起的，其中由遗传因素造成的耳聋约占所有耳聋患者的50%～60%[1]。按照遗传方式分类，遗传性耳聋又可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X 连锁遗传和线粒体遗传等[2-3]，其中线粒体遗传是一种母系遗传，其突变基因只能由母亲遗传给子代[4]，可能的原因是受精后的卵母细胞内存在可以针对性地破坏父源性线粒体DNA 的物质[5]。线粒体DNA 12S rRNA是氨基糖苷类抗生素诱导的非综合症性耳聋研究中的一个热点区域，其中A1555G 和C1494T 这两个位点的突变是目前公认的与药物性耳聋密切相关的致病性突变，可引起突变携带者对氨基糖苷类抗生素表现出高度敏感[6]，在应用常规治疗剂量甚至微量的氨基糖苷类抗生素之后，即可在短时间内引起听力不可逆的损伤，导致“一针致聋”的现象的发生[7-8]。了解江苏地区药物性耳聋基因线粒体DNA 12S rRNA 的突变情况，为制订本地区药物性耳聋的防治策略提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择江苏镇江、泰兴、如皋、高邮、涟水、沭阳6 个项目点中参加耳聋基因筛查的1843 例作为研究对象，按是否耳聋以及有无家族史分为三组，其中非综合征性耳聋患者904 例为耳聋组，男460 例，女444 例；平均年龄（25.39±12.04）岁；听力正常的耳聋患者家庭人员299 例为耳聋高危组，男139 例，女160 例；平均年龄（28.38±15.23）岁；听力正常的非耳聋患者家庭人员640 例为正常对照组，男288 例，女352 例；平均年龄（28.04±5.12）岁。904 例耳聋患者按地区分为苏南、苏中、苏北三组，其中镇江的254 例为苏南组，男126 例，女128 例；平均年龄（24.26±12.53）岁，泰兴、如皋、高邮的287 例为苏中组，男153 例，女134 例；平均年龄（26.13±13.13）岁，涟水、沭阳的363 例为苏北组，男181 例，女182 例；平均年龄（25.59±10.63）岁。耳聋组、耳聋高危组、正常对照组三组及苏南、苏中、苏北三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。所有研究对象自愿参加并签署知情同意书。本研究通过江苏省计划生育科学技术研究所医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 资料收集及标本采集 收集所有研究对象的基本信息、耳聋家族史、是否耳聋、以及耳聋发病原因等资料。抽取外周静脉血2～3 mL，EDTA 抗凝，冷链运输至本实验室后置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 基因组DNA 提取 采用血液基因组DNA 提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP319]，按照标准操作流程提取全血基因组DNA，将经微型分光光度计（博奥晶芯NanoQTM）检测DNA 浓度和纯度均符合实验要求的DNA 样本置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 线粒体DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突变检测 采用遗传性耳聋基因微阵列芯片检测试剂盒（博奥生物有限公司，货号：CP300065）、PCR 扩增仪（ABI Veriti 96 well Thermal Cycler）、芯片杂交仪（晶芯BioMixerTMⅡ）、芯片洗干仪（晶芯SlideWasherTM24）、芯片扫描仪（晶芯LuxScan 10K-B）等仪器对受检样本的线粒体DNA 12S rRNA 两个常见的突变位点A1555G 和C1494T 的突变检测，所有试验操作均严格按照SOP 进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组线粒体DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T突变率比较

耳聋组、耳聋高危组、正常对照组三组的A1555G和C1494T 突变检出率比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；耳聋组和耳聋高危组A1555G 和C1494T突变检出率显著高于正常对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；耳聋高危组与耳聋组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 三组线粒体DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 的突变率比较[例（%）]

2.2 不同地区耳聋患者线粒体DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 突变率比较

苏南、苏中、苏北三组A1555G 和C1494T 突变率比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苏北组A1555G和C1494T 突变率高于苏中组和苏南组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苏中组和苏南组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 不同地区耳聋患者线粒体DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 的突变率比较[例（%）]

2.3 耳聋患者发病原因分析

904 例耳聋患者中，40 例有氨基糖苷类抗生素用药史，165 例有打针/用药史但具体用药不详；109 例A1555G 和C1494T 位点突变的耳聋患者中，9 例有氨基糖苷类抗生素用药史，31 例有打针/用药史但具体用药不详。见表3。

表3 耳聋患者发病原因分析[例（%）]

3 讨论

药物性耳聋是指由氨基糖苷类药物如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素诱发的一种非综合征性遗传性耳聋[9]，其主要的致病机制为药物性耳聋基因线粒体DNA 12S rRNA 发生突变，其中最常见的突变位点为A1555G 和C1494T。A1555G 和C1494T 突变可使机体对线粒体蛋白的合成降低30%～40%，而氨基糖苷类抗生素的应用可在此基础上进一步降低线粒体蛋白的合成[10]，导致氧化磷酸化过程中ATP 生成减少以及毛细胞能量代谢障碍，最终引起听力下降甚至听力丧失。另有研究表明，C1494T 突变虽然可引起线粒体功能的轻度障碍和对氨基糖苷类抗生素的高度敏感，但尚不足以导致耳聋的发生，提示核修饰基因、线粒体单体型以及氨基糖苷类抗生素的应用等对耳聋表型的表达起着重要的调节作用[11-12]。氨基糖苷类抗生素具有较大的毒副作用，可引起听觉、前庭系统和肾脏不同程度的损伤[13]，其中对听觉和前庭系统的损伤往往都是不可逆的[14]。因其抗菌谱广、临床起效快、价格低廉等特点，目前仍被应用于临床，尤其是在发展中国家和一些偏远地区，更是临床的常规用药之一[15]。

线粒体遗传属于母系遗传，平均每检测出一个线粒体DNA 12S rRNA 基因突变携带者，可以发现10 个甚至10 个以上的携带有相同突变位点、但未发生药物性耳聋的母系家庭成员[16]。对于这些突变基因携带者，尤其是有生育计划的孕前女性，突变基因会100%遗传给下一代[17-18]。我国地域广阔，各地经济、卫生发展不均衡，且耳聋基因的分布类型以及分布频率在不同地区、不同民族间也具有差异性[19]。

本研究发现耳聋患者中A1555G 和C1494T 突变检出率为12.06%，明显高于徐彬等[20]报道的5.63%和李守霞等[21]等报道的2.61%，其中主要的突变位点和突变类型为A1555G 均质突变（11.06%），可能与研究对象不完全相同有关；耳聋高危组突变检出率为9.03%，均为A1555G 均质突变；正常对照组突变检出率为0.31%，均为A1555G 位点均质突变，与赵艳辉等[22]、巫静帆等[23]报道的数据相近。A1555G 和C1494T 突变具有母系遗传的特点，先证者所有母系家庭人员均携带相同的基因突变位点和突变类型，而本研究的研究对象中既有散发病例，也有耳聋家系，其中有部分耳聋家系被证实为药物性耳聋家系，其所有的母系家庭人员均携带相同的A1555G 均质突变[24-25]，从而导致A1555G 和C1494T 总的突变检出率相对较高。不同地区耳聋基因突变检出率不同，可能是耳聋基因的突变类型和突变频率在不同地区之间有一定的地域差异；与苏南、苏中比较，苏北经济、卫生发展相对落后，对药物性耳聋的防控知识的宣传相对较少，在农村等偏远地区氨基糖苷类抗生素应用频率较高，导致部分突变基因携带者因误用氨基糖苷类抗生素而导致听力的损失。而在苏南和苏中地区，部分突变基因携带者可能因未接触氨基糖苷类抗生素，其听力仍然表现为正常或仅轻度异常。对耳聋患者和具有A1555G 和C1494T 位点阳性突变的耳聋患者的发病原因进一步分析，发现有氨基糖苷类抗生素用药史的比例分别为4.42%、8.26%，部分有打针/用药史但具体的药物不详（18.25%、28.44%），大部分人群发病原因不明或未报告发病原因，可能是本研究中氨基糖苷类抗生素用药史比例较低的原因。

综上所述，在江苏地区人群中尤其是耳聋和耳聋高危人群中开展线粒体DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突变筛查，不仅可以为突变基因携带者提供及时的用药指导，避免药物性耳聋的发生或者加重已有的听力损失程度，而且对有突变母亲的子代亦可从新生儿期即开始采用有效的防控手段，终身避免使用氨基糖苷类抗生素，避免或推迟药物性耳聋的发生以及“因聋致哑”现象的发生，对优生优育的开展、出生缺陷的防治以及全人口综合素质的提高均具有重要的临床意义和社会意义。