童秋瑜 沈卫东 王 剑

上海中医药大学附属曙光医院针灸科，上海 201203

焦虑障碍严重影响患者生活质量，针灸对缓解其有明确疗效，但作用机制尚不清楚。内源性大麻素系统在应激焦虑发生中起重要作用，海马有高密度表达的大麻素受体下丘脑-垂体-肾上腺皮质（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）轴是人体应激反应的关键通路,其活动受海马精细调控。目前公认的机制是HPA轴功能持续亢进，体内糖皮质激素（glucocorticoid，GC）水平过度升高，从而导致相应部位的病理损伤。因此推测：海马内源性大麻素系统调控HPA 轴在电针治疗应激所致焦虑障碍中发挥重要作用。本研究探讨电针作用后海马内源性大麻素系统变化，阐明其对HPA轴相关神经内分泌因子和受体的调节以及在电针缓解应激所致焦虑行为改变中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采取4～8 周的雌性SD 大鼠，SPF 级（合格证编号：20180004019270），体重200～220 g，每只笼位饲养4～6 只大鼠，按照国家部属实验动物管理委员会制订的标准饲养，动物房温度23～25°C，相对湿度40%～50%，光照时间7∶00～19∶00；所有大鼠均都经过上海中医药大学实验动物管理机构的许可，并遵循了上海中医药大学所制订的有关实验动物保护和使用的指南。

1.2 主要试剂及耗材

AM-251（MCE 生产，货号：HY-15443）；针灸针（苏州医疗用品有限公司，0.35 mm×13 mm）；促肾上腺皮质激素（ACTH）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司，MM-0565R1）；皮质醇（CORT）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，MM-0559R1）；促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，MM-0520R1）；糖皮质激素（GC）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司生产，MM-0986R1）。

1.3 实验仪器或器械

大鼠自发活动箱（上海昆盟生物科技有限公司）；高架十字迷宫（上海昆盟生物科技有限公司）；束缚装置（上海昆盟生物科技有限公司）；电针仪（上海华谊医用仪器，BT701-1B）；全波长酶标仪（Thermo，multiskan GO）；全自动雪花制冰机（常熟雪科，MS-20）；超低温冷冻储存箱（美菱，DW-HL528S）。

1.4 实验方法

1.4.1 建立大鼠焦虑模型 采用单次延长应激法建立术前焦虑模型[1]，大鼠束缚2 h 后强迫游泳20 min，最后把大鼠放回笼位。具体简述如下：①取直径4 cm 的PVC 管（以不影响大鼠呼吸同时使之无法自由活动身体为准），截为40 cm 长的一段，一端封堵但保持透气，待大鼠放入后封闭另一端，静置保持2 h；②强迫游泳装置为一个直径80 cm 水池，水深50 cm，水面距水池上缘35 cm；强迫游泳20 min。③结束强迫游泳的大鼠用毛巾擦拭后，再以电吹风吹干毛发，休息15 min后，吸入异氟烷麻醉至意识消失放回笼内令其自然苏醒。通过评估旷场实验中大鼠边缘区域运动时间延长及高架十字迷宫实验开放臂停留时间降低来判断大鼠是否存在焦虑样行为。

1.4.2 实验动物分组与干预方法 具体分组如下（每组12 只）。对照组（正常饲养不做处理）；模型组（单次延长应激法焦虑模型）；假电针组（穴位附近刺浅表，留针不通电）；电针组（针刺百会、神门、内关、印堂，2 Hz，1 mA，持续15 min）；E：AM251（1 mg/kg 体重，针刺前30 min 腹腔注射）+电针组（穴位同电针组）；F：AM251+假电针组（方法同假电针组）。造模结束后的次日，开始对大鼠进行针灸及药物干预。对于针灸组的大鼠，主要参照《实验针灸学实验指导》和《大鼠穴位图谱的研制》[2]，选取百会、神门、内关、印堂四穴，以“华佗牌”一次性针灸用针（针径0.35 mm，长13 mm）进行针刺，定位及针刺方法如下。百会穴：顶骨正中，向后斜刺2 mm；神门穴：前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，直刺1 mm；内关穴：前肢内侧，距腕关节约3 mm 尺桡骨缝间，直刺1 mm；印堂穴：双眼之间中点向上约3 mm，向后斜刺2 mm。进针后连接电针治疗仪，设置2 Hz频率连续波刺激，电流强度1 mA，留针15 min，每天1 次，干预时间为3 d。对于假针刺组，于穴位附近刺浅表，留针不通电。对于AM251 干预组，每天于针刺前30 min，按照1 mg/kg 体重的剂量腹腔注射，其他各组注射等体积的生理盐水；AM251 是选择性大麻素1（CB1）受体拮抗剂

1.4.3 行为学检测 ①旷场实验（open field test）。针灸干预3 次后的次日进行旷场试验。观察指标：通过观察大鼠爬行中央格次数与时间、外周格次数与时间以及运动的总距离，计算出爬行的总格数、中央格爬行次数占爬行总格数的比例以及中央格停留时间占总时间的百分比[3]。大鼠三爪以上跨入邻格才能计数。旷场实验专用活动箱由不反光的黑色亚克力材料制成，l00 cm×100 cm×40 cm（长×宽×高），底板25 个20 cm×20 cm 方格，四周16 个方格为外周格，剩下的9 个方格为中央格，将大鼠放在中央格，观察5 min 内活动情况。在测试实验时保证整个环境安静无干扰。记录并分析数据，通过评估中央格爬行次数及停留时间来推测大鼠的焦虑样行为。每次实验后用75%酒精对旷场装置进行清理，消除异味。②高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）。EPM 实验将大鼠轻轻放至迷宫的中心区域，使之面向开放臂，记录大鼠6 min 内的探索活动。观察指标：大鼠进入开放臂次数及停留时间、闭合臂次数及停留时间[4]。实验装置由不反光的黑色亚克力材料制成，具体为两个闭合臂（50 cm×10 cm×40 cm），两个开放臂（50 cm×10 cm）及中心区域（10 cm×10 cm）连接而成，离地面约70 cm高。每只大鼠测试结束后，用75%酒精棉片擦拭实验装置以去除残留的气味。③ELISA 检测。使用试剂盒进行检测，所有步骤按说明书操作。测试完成后分别根据标准曲线，求出各组大鼠血浆中各值含量并进行统计分析。

1.5 统计学方法

采用Graph Pad 7 进行数据统计及图片数据处理。计量资料用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法。计数资料以例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对单次延长应激法大鼠模型焦虑行为发生的影响

通过旷场实验及高架十字迷宫实验评估大鼠焦虑行为，相对于对照组，模型组大鼠边缘区域运动时间延长，开放臂停留时间缩短，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，电针组中可见边缘区域运动时间缩短而开放臂停留时间明显延长（P ＜0.05）。与电针组比较，假电针组、AM251+电针组大鼠边缘区域运动时间延长，开放臂停留时间缩短，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

图1 电针对单次延长应激法大鼠模型焦虑行为发生的影响

2.2 电针对HPA 轴减轻焦虑的调控

相对于对照组，模型组血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白释放明显增加，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，电针组可以明显抑制上述蛋白在血清中表达，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与电针组比较，假电针组、AM251+电针组血清ACTH、CORT、CRH、GC 蛋白释放明显增加，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图2。

3 讨论

3.1 中医针灸在治疗创伤后应激所致焦虑障碍具有独特的优势

应激是指大脑在应对确定事件或环境时所表现出来的反应，慢性应激会产生一些有害的影响[5]。由于抗焦虑药物存在着许多的副作用或不良反应，限制了这些药物在临床上的广泛使用[6]。在西医治疗中的非药物疗法主要以心理疗法为主[7]。因此，开发新颖有效的治疗焦虑症方法已成为重要的医学和社会课题。

中医针灸可以缓解焦虑障碍改善焦虑情绪，尤其是对躯体症状[8]。目前，电针疗法应用于焦虑的治疗最为广泛[9]。本研究结果提示，电针具有很好减轻焦虑发生。因此需要进一步探讨针灸是如何减轻创伤后应激所致焦虑。

3.2 中医针灸激活海马内源性大麻素系统（eCB）减轻焦虑机制

图2 电针对HPA 轴减轻焦虑的调控

中医按照病情症状，将焦虑症归属于情志病的范畴[10]。内源性大麻素在中枢神经系统中主要结合突触前膜上的大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid 1 receptor，CB1R）[11]，可抑制神经递质的释放[12]。AM251 是CB1应用最为广泛的受体拮抗剂。在杏仁核内，在糖皮质激素促进内源性大麻素的释放同时，大麻素亦可以通过HPA 轴调控局部和远端糖皮质激素的分泌[13]。CB1R 在中枢神经系统中广泛分布。杏仁核-海马是调控情绪反应行为的关键区域，其内的CB1R 密度含量最高[14]。使用CB1R 拮抗剂治疗疾病可能破坏内源性大麻素系统功能，导致患者出现抑郁、焦虑样行为或症状[15]。最新研究发现电针刺激大鼠百会穴可调节海马上内源性大麻素受体CB1 的表达，提高内源性大麻素分解酶和合成酶的活性[16]。CB1 信号通路活化可产生针灸治疗时的相同生物学效应[17]。电针刺激的神经保护作用可被内源性大麻素受体拮抗剂阻断[18]。电针反复来刺激小鼠的百会穴通过CB1 受体能够产生明显的止痛效果[19]。AM251 可抑制电针刺激后大鼠CB1 受体的高表达，导致电针的镇痛作用减弱[20]。

3.3 HPA 轴在针刺治疗焦虑的作用

本研究通过ELISA 观察HPA 轴变化，主要通过测得血清中ACTH、CORT、CRH、GC 含量来反映出单次延长应激对成年老鼠HPA 轴的影响以及电针是否可以减轻其释放，阻断电针调配受体是否可以干预电针对HPA 轴的影响。HPA 轴是机体应激反应过程的中枢，CRH、ACTH、CORT 三者在HPA 轴上相互关联、相互影响。人体受到应激刺激时，CRH 可随着门脉系统的血液进入后垂体前叶，作用于垂体前叶使其释放ACTH，导致CORT 的分泌增加[21]。海马是应激损伤的敏感区及HPA 轴应激反应链上的高位负反馈调节中枢，可抑制HPA 轴的应激反应，并将HPA 轴在应激下的亢进功能恢复到正常水平[22]。HPA 轴活性与内源性大麻素系统紧密有关。内源性大麻素通过与突触前轴突末端的CB1 结合抑制γ-氨基丁酸及谷氨酸盐的释放。当缺失CB1 或使用受体拮抗剂后，ACTH 水平升高，糖皮质激素分泌增多。大麻素通过抑制下丘脑室旁核CRH 分泌性神经元谷氨酸盐的传入，减少CRH 的分泌，从而抑制HPA 轴所产生的应激反应[23]。HPA 轴兴奋，GC 分泌增多是应激最主要的神经内分泌反应之一。当过度应激，HPA 轴过度激活，高浓度的GC 可引起海马神经元变性和损伤，提示GC 对中枢神经系统的此类损伤很可能是心理应激导致精神损伤的机制之一[24]。针刺可能引起HPA轴功能改变。电针神门、三阴交可降低心理应激失眠大鼠CRH、ACTH、CORT 水平，而申脉、照海穴可调节HPA 轴上相关激素的释放或分泌，来治疗失眠[25]。以上研究提示，HPA轴是机体应激反应的主要通路，与内源性大麻素系统和针刺存在着紧密联系。本研究显示，HPA 轴的活化跟焦虑密切相关，其分泌的激素ACTH、CORT、CRH、GC 在某种方面导致焦虑发生，而电针通过CB1 受体调控HPA 轴抑制激素分泌减轻焦虑。

本研究探讨电针作用后海马内源性大麻素系统变化，通过构建单次刺激大鼠模型，采用旷场实验及高架十字迷宫实验行为学试验检测大鼠术后焦虑变化，并对其分泌蛋白的表达水平进行检测，证明了此通路在大鼠焦虑发生中的重要作用。本研究下一步继续扩大实验样本量，加深机制方面研究，深入探讨电针减轻焦虑的机制。