刘平原 沈思琪 武燕翔 陈连凤 严晓伟

100730 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院心内科

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)以内皮下脂质蓄积、粥样斑块形成及动脉管腔狭窄为特征，可引起冠心病、脑梗死、外周血管病等一系列疾病，是世界范围内最常见的疾病和死亡原因[1]。ABCG1是跨膜半转运体，在巨噬细胞中高表达并介导胆固醇外流，对体内脂质代谢稳态有重要作用。本课题组前期临床研究提示人类巨噬细胞ABCG1的表达可能具有促AS作用[2]，其机制尚待进一步研究。近来研究发现氧化固醇，如7β-羟基胆固醇(7β-hydroxycholesterol，7β-OHC)和7-酮基胆固醇(7-ketochlesterol，7-KC)等[3]，与AS的发生发展关系密切[4]。本实验通过构建ABCG1敲低单克隆稳转株，测定其氧化固醇外流情况，以探究ABCG1影响AS发生发展的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞(ATCC细胞库)，RPMI1640培养基、FBS(GIBCO公司)，引物(上海生物工程公司)，慢病毒表达载体、DH5α、转染试剂LipofectAMINE2000、NBD-胆固醇(Invitrogen公司)，DNA连接酶、限制性内切酶、反转录酶(Fermentas公司)，质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)，兔抗人ABCG1抗体(Abcam公司)，兔抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶偶联IgG(中杉金桥生物公司)，PMA、HDL(Sigma公司)，ox-LDL(北京协生生物公司)，质粒测序由Invitrogen公司完成。

1.2 稳转株构建

根据ABCG1基因序列设计shRNA oligo，将其连接到pGMLV-SC5RNAi载体构建慢病毒重组质粒，选取测序正确的质粒进行病毒包装；按照MOI=80利用慢病毒感染THP-1细胞，经有限稀释法筛选出稳定敲低细胞株；提取稳转株细胞总蛋白，并进行Western blot鉴定ABCG1表达。ABCG1 shRNA上游序列5’-gatccGGACCTGCTGAATGGACATCTT TCAAGAGAAGATGTCCATTCAGCAGGTCCTTTTTTg-3’，下游序列5’-aattcAAAAAAGGACCTGCTGAA TGGACATCTTCTCTTGAAAGATGTCCATTCAGCAGG TCCg-3’。阴性对照上游序列5’-gatccGTTCT CCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTT CGGAG-3’，下游序列5’-aattcACGCGTAAAAAA GTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAC ACGTTCGGAGAACg-3’。

1.3 巨噬细胞氧化固醇外流测定

1.3.1 细胞处理及样本收集 THP-1细胞以3×105/孔的密度接种于24孔板，以100 ng/ml PMA促进巨噬化。……