郭闯 刘学政

糖尿病视网膜病变(DR)是成年人视力损害的首要因素[1]，高血糖在DR的发生发展过程中发挥重要作用。微小核糖核酸(miRNA)是一种小的非编码RNA，能调节多种基因的表达，从而直接或间接参与疾病的发生发展。miR-218是一种与视网膜微血管内皮细胞增殖与凋亡密切相关的miRNA[2-3]，研究发现，miR-218在高浓度葡萄糖饮食的小鼠晶状体中高表达[4]，但是引发miR-218升高的相关机制以及miR-218对内皮细胞的影响目前仍不清楚。本研究主要探讨miR-218在高浓度葡萄糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells，rRMECs)凋亡中的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与主要试剂rRMECs(上海雅吉生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Hoechst 染色液(上海碧云天生物公司)，TaqMan MicroRNA检测试剂盒(上海Applied Biosystems公司)，Lipofectamine 2000(Lipo 2000)、Trizol试剂盒(美国Invitrogen生物公司)，实时定量 PCR试剂盒、miR-218抑制剂、miR-218阴性抑制剂、cDNA逆转录试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)，Caspase-3抗体、β-actin抗体(上海Abcam公司)。

1.2 细胞处理及实验分组将细胞培养达80%融合时弃去完全培养基，随后置于无血清且含有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中按照10×106个·L-1的密度接种于6孔培养板，培养过夜后进行分组。将细胞分为对照组、高糖组、miR-218阴性抑制组和miR-218抑制组。对照组细胞用DMEM低糖培养基培养；高糖组在培养基中添加D-葡萄糖，终浓度为25 mmol·L-1；miR-218抑制组及miR-218阴性抑制组是在高糖组培养基的基础上，按照说明书操作，利用Lipo2000将miR-218抑制剂和阴性抑制剂转染rRMECs，共同孵育24 h。

1.3 总RNA提取与miR-218含量分析利用Trizol试剂盒从rRMECs中提取总RNA。首先用氯仿提取RNA，然后离心分离样品为水相和有机相。……