马乐，张博，刘元峥，苗静，高志国，薄晓菲

（北京生物制品研究所有限责任公司，北京 100176）

R2A琼脂培养基是一种检测饮用水中微生物总数的培养基，具有低浓度的营养物质，用较低的培养温度和较长的培养时间来刺激受损和耐氯微生物的生长。营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基等营养丰富的培养基，适合培养快速生长的微生物，但可能会抑制部分生长缓慢或受损的微生物。与这些培养基相比，R2A琼脂培养基更有利于水中受损和耐氯微生物的生长[1]。本文通过对R2A琼脂培养基平皿有效期的验证，证明该培养基平皿在规定时间和贮存条件下，产品质量的稳定性适合生产所需。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]，购自中国食品药品检定研究所。注射用水，磷酸盐标准缓冲液（pH 6.86）、硼砂标准缓冲液（pH 9.18）、氯化钠、过滤器与滤膜由北京生物制品研究所有限责任公司提供。营养琼脂培养基干粉、玫瑰红钠琼脂培养基干粉由北京三药科技开发公司提供。R2A琼脂培养基干粉由美国BD公司提供。沙氏葡萄糖琼脂培养基干粉由北京奥博星公司提供。

XG1.G型脉动真空蒸汽灭菌柜，山东新华有限公司；PHS-3D pH计，上海三信有限公司；ES-122P电子天平，北京湘平有限公司；masterclave 60培养基制备器、APSone90培养基分装机，购自于法国梅里埃生物公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基平皿的制备

（1）R2A琼脂培养基平皿。取18.5 g R2A琼脂培养基干粉和1 000 mL注射用水置于培养基制备器中，执行121 ℃高压灭菌15 min的程序，待降温至42 ℃后在洁净度以C+A的环境下（且符合该级别环境要求），连接培养基分装器分装平皿，测得培养基pH值在7.2±0.2的合格范围内待用。

（2）营养琼脂培养基平皿。取30 g 营养琼脂培养基干粉加热溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高压灭菌15 min，灭菌后pH值7.2±0.2，在洁净度以C+A的环境下（且符合该级别环境要求）倾倒平皿，经无菌验证及pH测定合格后待用[2]。

（3）玫瑰红钠琼脂培养基平皿。称取玫瑰红钠培养基干粉，加热溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高压灭菌15 min，灭菌后pH值6.0±0.2，将培养基置于洁净度以C+A的环境下（且符合该级别环境要求）倾倒平皿，经无菌验证及pH测定合格后待用。

（4）0.9%氯化钠溶液。将9 g NaCl溶于1 000 mL注射用水，搅拌溶解后除菌过滤，121 ℃高压灭菌40 min后待用。

（5）沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿。称取沙氏葡萄糖琼脂培养基干粉，加热溶解于注射用水1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min，灭菌后pH值5.6±0.2，置于洁净度以C+A的环境下（且符合该级别环境要求）倾倒平皿，经无菌验证及pH测定合格后待用[2-3]。

1.2.2 菌悬液制备与菌种接种

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养琼脂培养基上，30～35 ℃培养18～24 h；将白色念球菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25 ℃培养24～48 h。以上菌种均需进行两代传菌后，用0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含菌数小于100 CFU的菌悬液备用。将黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25 ℃培养5～7 d，进行两代传菌后的新鲜培养物加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%无菌氯化钠溶液，将胞子洗脱；然后，吸出胞子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含胞子数小于100 CFU的胞子悬液[3]。

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌制备成的菌悬液接种在R2A琼脂培养基平皿和营养琼脂培养基平皿上，置30～35 ℃温房培养48 h后对计数结果进行数据分析。将白色念球菌与黑曲霉制备成的菌悬液接种在R2A琼脂培养基平皿和玫瑰红钠琼脂培养基平皿上，置23～28 ℃温房培养72 h后对计数结果进行数据分析，每种菌各接种10个平皿计数。因黑曲霉菌落为片状，无法在培养皿中计数，故用培养基平皿接种黑曲霉后的生长状态照片来说明情况。

1.2.3 薄膜过滤法对工艺用水微生物的限度检查

在理化指标上，注射用水（＜10 CFU/100 mL）对微生物要求要高于纯化水（＜100 CFU/mL），故本次实验选取注射用水进行微生物限度检查，取已高压蒸汽灭菌的0.25 μm孔径的滤膜（直径47 mm）、过滤器，将滤膜放在网盘上，组装好滤器。将200 mL注射用水经滤器过滤后，取出滤膜，菌面朝上贴于R2A、营养琼脂、玫瑰红钠琼脂培养基平皿上各5块，置于30～35 ℃培养房中倒置培养5 d，计数滤膜上的菌落数（标准为逐日点计菌落数，菌落蔓延生长成片的平皿不计数），计算菌落检出率并制表分析。

1.2.4 对R2A琼脂培养基平皿进行培养基有效期的验证

连续生产3个批次的R2A琼脂培养基平皿，命名为 201703S001、201703S002、201703S003，每批次分别在0 d、30 d、60 d、90 d、100 d各取样50块进行质量检测。如遇节假日，取样可在计划时间点内的±2 d施行。整个存放时间内，R2A琼脂培养基存放环境的温度应控制在18～25 ℃。检定项目为培养基pH值、外观、适用性（灵敏度）和无菌性检查。平皿质量合格体现在4个参数上。（1）适用性：要求备检培养基上的菌落平均数不少于对照培养基上的菌落平均数的70%；（2）pH值：灭菌后的pH值为7.2±0.2；（3）平皿外观：无破裂，无裂纹，无明显气泡，无琼脂凝块；（4）无菌性：无染菌，无微生物生长。如在第100 d时样品检定时能达到以上的质量标准，则将R2A琼脂培养基平皿的有效期规定为90 d。

适用性检查：接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上，30～35 ℃培养18～24 h，经两代传菌后，将上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成100 CFU/mL的菌悬液，备用。将两种菌种稀释好的菌悬液0.1 mL接种于实验组的待检培养基平皿和对照组的R2A琼脂培养基上，然后用L-棒涂抹均匀，放置于30～35 ℃培养房中培养24～48 h后计数。

pH值的测定：对操作间温度及pH计进行两点法校正后，用纯化水充分洗涤电极，吸尽水分，将pH电极头插入样品中，显示值稳定后读取pH值。

回收率计算：根据公式（1）计算回收率。

平皿外观与无菌性观察：将所生产平皿按比例（50∶1）进行留样外观及无菌性检查，放于20～25 ℃培养房中倒置培养14 d。培养期间应逐日观察并记录是否有菌落生长，平皿外观无菌性的结果由所拍摄的平皿样品照片来表示。

1.3 重复性

用以上方法进行平行试验3次。

1.4 数据分析

根据医学统计学方法对适用性检查数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 适用性检查

由表1可知，R2A培养基与营养琼脂培养基在接种铜绿假单胞菌与大肠埃希菌的3次实验结果均有显著差异（P≤0.05），接种在R2A培养基上的菌落数平均数高于营养琼脂，说明R2A培养基在接种铜绿假单胞菌与大肠埃希菌的菌落长势强于营养琼脂培养基；R2A培养基与营养琼脂培养基接种金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的3次实验结果均没有显著差异（P＞0.05），说明R2A培养基接种金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的菌落长势等同于营养琼脂培养基。综上所述，R2A培养基接种细菌微生物的效果均强于营养琼脂培养基。

表1 R2A琼脂培养基与营养琼脂培养基P值比较

由表2可知，R2A培养基与玫瑰红钠琼脂培养基在接种白色念球菌后3次结果均无显著性差异（P＞0.05）[4]，说明R2A培养基在接种真菌微生物效果与玫瑰红钠琼脂培养基相同。

由图1可知，黑曲霉接种在玫瑰红钠琼脂和R2A琼脂培养基平皿上，在室温23～28 ℃培养72 h，菌落开始为白色，柔软有光泽，逐渐形成绒毛状或絮状丝状菌落，培养7 d后菌落直径可达2～3 cm，出现黑心，形成黑色的分生孢子头。虽然黑曲霉在玫瑰红钠琼脂培养基上的长势（形态和色泽）优于R2A琼脂培养基，但这两种培养基作为计数培养基，更侧重于是否可以检测出霉菌的数量，长势不是本次试验的目的。所以R2A琼脂培养可替代玫瑰红钠琼脂培养基应用于霉菌微生物的适用性检查。

图1 黑曲霉在玫瑰红钠、R2A琼脂培养基上生长情况

综上所述，R2A琼脂培养基可替代营养琼脂、玫瑰红钠琼脂培养基应用于微生物的适用性检查。

2.2 注射用水样品微生物限度检查

对注射用水微生物限度检测结果用柱状图方法进行数据处理，得出如图2所示结果：在3次平行试验中，R2A琼脂培养基在注射用水微生物限度检测中检出率均大于营养琼脂、玫瑰红钠琼脂培养基，说明R2A琼脂培养基能够替代营养琼脂、玫瑰红钠琼脂培养基应用于注射用水微生物限度检查[5]。

图2 平行3次实验注射用水检查平均数

2.3 灵敏度检查

从图3可看出，3批R2A培养基平皿中枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的回收率均超过70%。表3数据表明，这3批次被检培养基灭菌后pH值均在合格范围（7.2±0.2）内[3]。

表3 R2A琼脂培养基平皿参数比较

图3 枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌回收率

2.4 外观与无菌性观察

由图4可知，平皿在制备后于18～25 ℃的常温库中培养100 d，外观上无破裂，无裂纹，无明显气泡，无琼脂凝块；平皿在制备后于20～25 ℃的培养房中培养至100 d，无染菌现象。说明到第100 d时，样品所需检定项目均达到质量标准，所有R2A琼脂培养基平皿的有效期规定为90 d。

图4 平皿外观与无菌性情况

R2A琼脂培养基可取代营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基对工艺用水菌落总数的测定，与欧盟标准接轨，符合2015版《中华人民共和国药典》要求。R2A琼脂培养基平皿自制造之日至第100 d，外观、pH值、无菌检查、培养基适用性（灵敏度）检查等项目结果均合格，可以满足使用需求，依照R2A有效期验证方案，将R2A琼脂培养基平皿有效期规定为90 d。