郑刚，王奇，肖金星，杨志坚，陈冲，赵小立*

（1.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山 316100；2.浙江大学生命科学学院，浙江杭州 310058）

胶原蛋白酶是能在一定的pH和温度下切割胶原蛋白主体螺旋多肽链的酶类[1]；胶原蛋白降解酶指的是一类能降解天然非变性胶原蛋白的酶[2]。胶原蛋白酶是重要的商业化酶，许多细菌来源的胶原蛋白酶已被成功鉴定和表征。尽管海洋中的生物资源丰富，但是这些商业化酶中很少有海洋来源，特别是海洋细菌。本研究旨在筛选出一株产胶原蛋白酶的海洋细菌，提高水产品加工厂中废弃物的利用率。通过透明圈法筛出一株产胶原蛋白酶菌株，通过肉眼初步观察其形态学特征，随后提取其16S rRNA序列进行比对，以确定其种属来源；同时构建进化树，确定其亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

UNIVERSAL HOOD凝胶成像仪，BIO-RAD；eStain L1蛋白染色仪，金斯瑞；R 134 a冷冻离心机，Eppendorf；H1850R医用离心机、TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪；DW-86L386超低温冰箱，青岛海尔；YXQ-LS-50 S Ⅱ高压蒸汽灭菌锅、SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯；eclipse E200光学显微镜，Nikon；HS-840超净工作台，苏净安泰；UV-1800分光光度计，Shimadzu；ZQZY-88CN摇床，上海知楚；AL204电子天平、FiveEasy pH计，METTLER TOLEDO。

1.2 材料与试剂

葡萄糖（99%），琼脂粉、蛋白胨、酵母粉、Triton X-100为分析纯，购自上海生工；明胶，三氯乙酸、乙二醇甲醚为分析纯，购自阿拉丁；二水还原茚三酮，分析纯，购自源叶生物；水合茚三酮，分析纯，购自阿法埃莎公司；乙酸、乙酸钠、氯化钙等为分析纯，购自国药公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、5×非变性蛋白上样缓冲液，购自上海碧云天。

1.3 溶液制备

划线培养基：1.0%明胶、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖，加去离子水至1 000 mL，调节pH至7.5，115 ℃下高温灭菌20 min；……