阳春苗，王秋玲，梁芳，黄艳红，覃日宏，杨小良

（广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西南宁 530223）

无患子，又名油患子、洗手果，为无患子科无患子属植物，以根与果入药，主产于我国广东、广西、台湾等长江流域以南地区[1]。无患子果皮为无患子假种皮，三萜类皂苷是其主要成分，具有抗炎抗菌、清热化痰、镇痛、降压、降胆固醇等药理作用，也有类肥皂的作用，是医药和日化行业的一种重要原料，具有良好的市场开发前景。

文献报道的从无患子中提取皂苷的方法有多种[2]，其中超声提取法时间短、操作方便简单、提取效率高，在天然产物提取中应用广泛。本研究采用Box-Behnken响应面法对无患子果皮皂苷的超声辅助提取工艺进行优化，以期为无患子果皮的开发利用提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生无患子果皮，采集于广西南宁市邕宁区，经鉴定为无患子科植物无患子Sapindus mukorossi Gaertn.的果皮。

1.2 仪器与试剂

高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；XS105DU电子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅，金坛市医疗器械厂；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

齐墩果酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；95%乙醇、冰乙酸、甲醇，分析纯，西陇化工股份有限公司；香草醛，分析纯，天津市光复精细化工研究所；高氯酸，分析纯，上海朗源化工有限公司。

1.3 方法

无患子果皮中的三萜皂苷主要是齐墩果酸型[3]，本实验以齐墩果酸标准品作为对照品，测定超声提取法得到的无患子果皮总皂苷含量。

1.3.1 标准曲线的绘制

精密称取齐墩果酸标准品10 mg，以甲醇溶解后定容至100 mL，得齐墩果酸标准溶液浓度为0.1 mg/mL。取齐墩果酸标准溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL加入6支比色管中，每个浓度设3个平行样品，置于70 ℃水浴中挥干甲醇，随后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL为显色剂，摇匀，于70 ℃恒温水浴锅中加热15 min，冰水浴中冷却3 min，加入5 mL冰醋酸为溶剂，摇匀。以空白溶液作参比，用紫外可见分光光度计在400～600 nm扫描光谱，确定最大吸收波长后以此波长为条件测定吸光度[4]。以横坐标为齐墩果酸对照品质量浓度，纵坐标为吸光度绘制标准曲线，求出回归方程。

1.3.2 供试品溶液的制备

采摘当年成熟无患子果实，取果皮置于烘箱中60 ℃烘干、粉碎，过20目筛。准确称取无患子果皮粉末1 g，置于25 mL锥形瓶中，按照设定的乙醇浓度、物料比和提取时间进行超声提取，过滤得提取液，将提取液用甲醇定容稀释100倍即得样品溶液。精密量取0.2 mL样品溶液置于比色管，用“1.3.1”处理齐墩果酸标准品的相同方法得到无患子果皮提取物待测溶液，于“1.3.1”下测得的最大吸收波长下测定吸光度，代入回归方程，计算样品中总皂苷的得率。

1.3.3 单因素实验设计

对乙醇浓度、物料比、提取时间3个影响无患子果皮皂苷提取效果的参数进行单因素实验，分别考察乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；物料比 1∶ 10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，（g∶mL）；提取时间10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 等不同条件对皂苷得率的影响[5]。

1.3.4 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，运用Design-Expert 8.0.6分析软件，根据Box-Behnken设计原理，以无患子果皮皂苷得率为响应值，以乙醇浓度、物料比、提取时间为自变量，设计3因素3水平的响应面优化实验，求出实验模型，以确定超声辅助提取无患子果皮皂苷的最优工艺[6]。实验因素水平见表1。

表1 响应面设计因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线

齐墩果酸标准溶液通过香草醛-高氯酸法显色后在400～600 nm扫描光谱，在547 nm处有最大吸收，得回归方程为Y=0.058 7X-0.037 4，R2=0.099 91，线性范围 3～12 μg/mL。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 乙醇浓度影响

按照“1.3.2”无患子果皮皂苷提取处理方法，物料比1∶10、提取时间30 min、乙醇浓度在30%～90%时测得无患子果皮皂苷得率与乙醇浓度的关系见图1。

图1表明，浓度为30%～60%时，皂苷得率随乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度60%时，得率达到最大为15.33%；乙醇浓度大于60%后，皂苷得率逐渐下降，可能与乙醇浓度增大后溶剂极性降低，杂质溶出增多有关。因此，选择最佳乙醇浓度为60%。

2.2.2 物料比影响

按照“1.3.2”无患子果皮皂苷提取处理方法，乙醇浓度60%，提取时间30 min，在50 ℃下物料比在1∶10～40时测得无患子果皮皂苷得率与物料比的关系见图2。

图2表明，物料比在1∶10～20，得率呈上升趋势，在1∶20时得率达到最大为17.43%，说明此条件下的物料浓度差最有利于皂苷的溶出，随后逐渐下降，可能是其他杂质溶出也增加后影响了皂苷的得率。因此，选择最佳料液比为1∶20。

图2 物料比对无患子皂苷得率的影响

2.2.3 提取时间影响

按照“1.3.2”无患子果皮皂苷提取处理方法，乙醇浓度60%、物料比1∶20、50 ℃条件下提取时间分别为10～60 min时，测得无患子果皮皂苷得率与提取时间的关系见图3。

图3表明，在10～30 min提取时间内，时间越长无患子果皮皂苷得率越高，30 min时得率最大为17.40%，继续增加提取时间得率略有下降。说明超声时间30 min使皂苷在物料和溶剂之间的传递已到达平衡，继续增加时间不仅皂苷溶出量不会增多，反而会使分子结构遭到破坏。因此，选择最佳提取时间为30 min。

图3 提取时间对无患子皂苷得率的影响

2.3 响应面实验结果与分析

2.3.1 回归模型建立与分析

根据试验设计方案，共设计了17个试验点，由12个析因试验和5个中心试验组成，试验方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果

根据表2的实验设计进行多元回归拟合分析，以无患子果皮皂苷得率（Y）为指标，拟合后获得了三因素的二次多项回归模型为：Y=-6.053 25+0.230 73A+0.992 05B+0.407 55C+0.005 25AB+0.001 2AC-0.005 1BC-0.003 2425A2-0.027 97B2-0.006 467 5C2

为了检验无患子果皮皂苷提取工艺回归方程的有效性，对软件建立的模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归结果方差分析

表3显示，该模型P=0.000 7＜0.001，说明回归模型差异显著。失拟项P=0.080 1＞0.05，模型失拟项没有显著性差异，拟合性良好可以用于分析实验结果。决定系数R2=0.953 7，说明回归模型与实际测量值具有较高相关性，超声提取无患子果皮皂苷可以用此回归方程进行结果预测。通过表中各因素P值可知，3个因素对超声提取无患子皂苷得率的影响从大到小依次为B（料液比）、A（乙醇浓度）、C（提取时间）。显著性影响因素包括A、B、AB、BC、A2、B2、C2，而C、AC为不显著因素，一次项总体影响显著（P＜0.05），二次项总体影响极其显著（P＜0.001）。

为了直观反应分析结果，利用Design－Expert8.0.6软件绘制响应面分析图与等高线图，结果如图4所示。

图4 各因素交互作用对响应值的效应面与等高线

2.3.2 无患子果皮皂苷超声提取最优工艺验证

根据模型回归方程确定超声辅助提取无患子果皮皂苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度69.43%，物料比1∶21.56，提取时间29.44 min，在此条件下皂苷得率为16.19%。对最佳工艺进行3次重复平行验证实验，结果皂苷平均得率为16.17%（RSD=0.928%），与模型预测结果吻合较好。实验结果表明，优化的皂苷提取工艺稳定可行，重复性良好，响应面法优化的参数具有一定的实用价值。

3 结论

本实验在单因素实验中，研究了不同因素对超声辅助提取无患子果皮皂苷得率的影响，依据单因素实验结果选取了对得率影响较大的乙醇浓度、物料比和提取时间3个因素进行响应面考察，且确定各因素的水平设置。实验通过响应面优化超声提取无患子果皮皂苷的提取工艺，结果显示，乙醇浓度和物料比对得率的影响显著，提取时间影响不显著。经响应面优化得出超声提取无患子果皮皂苷的最佳工艺条件为乙醇浓度69.43%、物料比1∶21.56、提取时间29.44 min，此条件下的得率为16.19%，通过验证实验，实际得率值为16.17%，RSD值为0.928%，此法适用于优化超声提取无患子果皮皂苷，为无患子资源的进一步综合开发利用提供了实验依据。