蔡卫梅,李伟伟,陆志红,杨留中

新乡医学院第一附属医院肿瘤科三病区(河南卫辉 453100)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要类型之一，早期易被忽略，大多患者就诊时进展至中晚期，常采用姑息性治疗，5年生存率<20%，预后较差[1]。而复发与转移是NSCLC治疗失败的主要原因，因此研究复发与转移的相关机制及预后的影响因素意义重大。Kruppel样转录因子9(Kruppel-like factor 9，KLF9)系基因调控因子，能通过转录激活域或转录抑制域与核定位信号发挥转录调节因子功能，在黑色素瘤、胰腺癌中表达异常，并能调控细胞增殖、迁移、侵袭[2-3]。转录因子激活增强子结合蛋白4(transcription factor activating enhancer binding protein 4，TFAP4)是碱性螺旋环-螺旋转录因子家族成员，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用，其水平升高，可促进胃癌细胞迁移和侵袭[4-5]。但现阶段关于KLF9、TFAP4在NSCLC患者中与临床病理特征关系的研究较少，对预后的影响仍不明确，本研究对此进行探讨，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2014年1月至2016年8月收治的NSCLC患者94例作为研究对象，均符合NSCLC诊断标准[6]，入组时首次确诊，可耐受活检，无放化疗等相关治疗史，无肺结核，并同意配合随访，排除合并自身免疫疾病、存在认知、精神障碍者。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂、仪器 Trizol总RNA抽提试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、DNA marker(上海生工生物工程公司)；PCR仪(美国ABI公司，7500)；恒温振荡器(太仓市科教器材厂)；高速离心肌(Heraeus公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；调速振荡器(金华市富华仪器有限公司)。

1.2.2 检测方法 入组者均于入院后治疗前，活检采集NSCLC组织标本，放入液氮冷冻，标本采集前均无NSCLC相关治疗史。自液氮中取100 mg标本，研钵中迅速研磨至粉末，加入1 mL Trizol试剂，并转入1.5 mL EP管中，反复吹打至充分溶解，室温放置10 min。加入0.2 mL氯仿，低温充分震荡10 min，室温放置5 min，12 000 r/min离心15 min，可见样本分为3层，小心吸取上层水相至新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入用0.1%DEPC水配的70%乙醇 1 mL，7 500 r/min离心5 min，上清弃去，倒扣EP管吸干水分，空气干燥10 min。加入40 μL左右0.1% DEPC水溶解沉淀，吹打混匀，-80℃保存。逆转录前取2 μL总RNA溶液，采用紫外分光光度仪260与280 nm波长下测定OD值，以验证RNA纯度与浓度，OD260/280介于1.80～2.00为符合要求。取总RNA溶液10 μL，加入1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)、1 μL RNase free ddH2O，65℃温浴5 min，再冰浴30 s，加入5×Reaction Buffer 4 μL、M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 2 μL、RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，内参β-actin上下游引物分别……