刘道华，汪天平

安徽省寄生虫病防治研究所，安徽 合肥 230601

弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫寄生人体导致的人兽共患机会性寄生虫病，呈世界性分布。免疫机能正常者感染弓形虫常呈自限性，无明显临床表现，多呈隐性感染状态。AIDS患者和肿瘤患者等免疫功能低下者感染弓形虫常导致严重后果，主要表现为脑炎、视网膜脉络膜炎或精神异常等，严重者可引起死亡[1-2]。孕妇感染弓形虫可通过胎盘垂直传播，引起不良妊娠结局，或引起婴儿先天性弓形虫病[3-5]。

目前，弓形虫病的诊断方法主要分为病原学方法、免疫学方法及分子生物学方法。病原学检测包括直接镜检、滋养体检查及动物组织内包囊的检查等。但病原学检测所需时间较长，且敏感性和特异性较差。免疫学方法主要检测血清或组织液等标本中的弓形虫抗体，适用于流行病学调查，但易出现假阳性，只能作为弓形虫病的辅助诊断。分子生物学技术的许多新方法也逐渐应用于弓形虫病的诊断，为弓形虫病的诊断提供了强有力的技术支撑。本文旨在对分子生物学的新技术和新方法在弓形虫病诊断中的应用及发展前景等进行综述。

1 核酸分子杂交

核酸分子杂交技术是依据核酸分子的变性、复性，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按照碱基互补配对的原则形成杂交双链分子。核酸分子杂交具有特异性高、灵敏性强等优点，国内外学者陆续将其应用于弓形虫病的诊断。

夏爱娣等[6]采用32P标记的弓形虫DNA探针与无脑儿、脑积水及死胎标本的DNA进行核酸分子杂交，成功检测出弓形虫阳性标本。陈海峰等[7]用RH株弓形虫抗原SAG1基因编码序列，构建pcDNA3-SAG1重组表达质粒，运用核酸分子杂交方法可以检测弓形虫SAG1的存在。张洪花等[8]应用生物素标记的核酸探针检测脑囊虫病人、癫痫患者及健康人群的弓形虫感染状况，发现核酸分子杂交技术可应用于弓形虫病的现场调查。此外，研究者通过PCR扩增弓形虫TGR4核酸片段，用地高辛标记探针和待测样本进行核酸杂交，结果显示，此探针不仅特异性较好，且具有较好的敏感性[9]。国外相关研究者采用同位素标记探针的酶联免疫渗滤试验检测弓形虫的DNA，结果发现核酸分子杂交技术具有较好的敏感性、特异性，还可节约时间，实现操作的自动化[10]。

2 聚合酶链式反应(PCR)

20世纪80年代，美国PE公司成功推出了一套快速DNA扩增系统，使目的DNA片段的拷贝数扩增至百万倍以上，具有特异、敏感和操作简便等优点[11]。随着PCR技术的深入研究和快速发展，衍生出了巢氏PCR、荧光定量PCR、原位PCR、多重PCR等相关技术，这些方法均逐渐应用于弓形虫病的诊断。

2.1常规PCR PCR利用碱基互补配对的原则，经高温变性、低温复性、子链延伸的不断循环，在体外快速、选择性地扩增目的基因。 谢德华等[12]以弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为遗传标记，利用上游引物：5'-GATTTGCATTCAAGAAGCGTGATAGTAT-3'，下游引物：5'-AGTTTAGGAAGCAATCTGAAAGCACATC-3'，构建了PCR诊断方法。该方法可检测出10个弓形虫速殖子DNA，且与其他8种原虫和线虫均无交叉反应，证实该方法具有较高的灵敏性和特异性。此外，有关学者以弓形虫高度重复基因序列 529 bp建立了PCR诊断方法，最低可检测出10个拷贝的弓形虫DNA片段[13]。

PCR技术建立起来后，迅速应用到临床试验。研究者采用PCR技术对生殖道、分泌物、孕妇和3个月以下婴儿全血进行弓形虫感染的检测，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了比较分析，证实了PCR技术检测弓形虫感染具有较高的可靠性[14-15]。

2.2巢式PCR 巢式PCR是对常规PCR技术的完善、改进及发展，应用两对引物扩增DNA片段。Fuentes等[16]首次采用根据弓形虫B1基因建立了巢氏PCR，所用上游引物：5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3'，下游引物：5'-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3'，并用该方法检测尿液中弓形虫DNA，进行婴儿先天性弓形虫病的产前诊断。另外，国外有学者根据弓形虫B1基因构建了巢式PCR，并证实该方法可确诊弓形虫性视网膜脉络膜炎[17]。张莹光等[18]根据弓形虫529 bp重复序列设计引物，建立巢式PCR检测方法，检测出0.1 pg的弓形虫DNA，其最低检测限比常规PCR提高了100倍，且该方法对蜥蜴利什曼原虫、隐孢子虫、细粒棘球绦虫基因组扩增无条带，特异性强。程宁等[19]采用巢式PCR对早产儿和正常新生儿进行弓形虫DNA的筛查，结果发现早产儿弓形虫感染率较高，提示弓形虫感染可能是引起早产的危险因素之一。

随着巢式PCR的发展，又出现了半巢式PCR技术。半巢式PCR应用3条引物而进行2次PCR扩增，具有操作简便、特异性强、灵敏性高等优点。王素华[20]利用弓形虫RH株的P30基因设计了3条特异性引物P1、P2及P3，成功构建半巢氏PCR 检测技术，并证实该方法灵敏性高，可检测18 fg的弓形虫DNA。孔得翔等[21]同样利用弓形虫的P30基因为作为研究对象，建立了半巢式PCR检测体系，证实了最低可检测18 fg的弓形虫DNA，极大地提高了检出率，为弓形虫早期诊断奠定基础。

2.3荧光定量PCR 荧光定量PCR，又称为实时定量PCR，将探针技术与PCR技术有机结合，通过测定PCR产物中的DNA含量来定量分析待检样本中目的DNA或者mRNA的含量。

近年来，国内外学者根据GenBank中弓形虫529 bp重复序列、GRA7基因、B1基因及GRA6基因分别设计荧光定量PCR的引物，成功构建了弓形虫荧光定量PCR检测方法[22-23]。研究者还利用构建的荧光定量PCR方法，对无偿献血者进行弓形虫感染的筛查，对病死猪及组织样品进行弓形虫感染情况的检测，并与常规PCR方法进行比较分析，结果发现荧光定量PCR法的检出率显著高于常规PCR法[24]。此外，采用特定荧光定量PCR引物对新孢子虫、牛巴贝斯虫等寄生虫DNA的检测，结果均为阴性，显示出较好的特异性[25]。因此，荧光定量PCR比常规PCR技术更加快捷、敏感、准确，适合临床实验室及相关标本弓形虫感染的检测。

2.4原位PCR 1990年，Hasse等人将PCR技术和原位杂交技术结合在一起，成功建立了原位多聚酶链式反应技术，简称原位PCR[26]。原位PCR将原位杂交的定位性与PCR的高度敏感性结合，极大地提高了原位杂交对低复制样品检测的敏感性，克服了PCR技术因扩增产物无法在细胞组织中定位而不能与形态学特征结合的不足。

李爽等[27]以弓形虫RH株的速殖子感染小鼠，取肝脏制备了石蜡标本及冰冻切片标本，采用直接原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA，结果弓形虫病原体检出率为100%，显著优于免疫组化法。卢慎[28]应用间接原位PCR技术，检测3所医院共86例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎患者石蜡包埋切片组织中的弓形虫DNA，结果发现47例弓形虫阳性，占54.65%。此外，他还采用免疫组化、原位杂交及间接原位PCR技术三种方法，检测71例诊断为慢性非特异性淋巴结炎(淋巴结反应性增生)患者组织切片中的弓形虫，结果发现，间接原位PCR的检出率明显高于免疫组化和原位杂交法[29]。

2.5多重PCR 多重PCR(MPCR)又称多重引物PCR或复合PCR技术，是1988年Chamberlian等首次提出的[30]。多重PCR的主要优势是在同一个反应体系中加入两对或两对以上引物，分别扩增不同的模板，可同时得到不同的目的片段。因此，多重PCR技术不但保留了常规PCR方法的特异性及敏感性，而且减少了操作步骤和试剂用量，提高了检测效率，节约了检测成本。

赵锦等[31]成功构建了可同时检测弓形虫和乙肝DNA的多重PCR，以乙肝病人血液及弓形虫RH实验动物腹水为样本，通过基因片段筛选，进行弓形虫和乙肝病毒基因片段的扩增，证明该方法能够有效诊断弓形虫感染，可用于弓形虫感染的实验室筛查。彭武丽等[32]以牛新孢子虫Nc-5基因和弓形虫GRA6基因作为目的基因，各设计一对PCR引物，建立了可同时检测牛新孢子虫和弓形虫的双重PCR方法，并用该方法对临床样品进行筛检，证明此方法具有较好的特异性和重复性。于新友等[33]依据GenBank中猪弓形虫和附红细胞体核苷酸序列，分别设计两对引物，优化双重PCR反应条件，成功构建了双重PCR检测体系，此方法可同时进行这两种病原的检测。

3 环介导等温扩增技术(LAMP)

2000年，日本学者Notomi等人研发了一种快速、简单、灵敏、特异且低成本的恒温核酸扩增技术，即LAMP技术[34]。LAMP技术具有扩增效率高、操作步骤简单、灵敏性极高、特异度好、结果判定简便等诸多优点。LAMP技术一经问世，迅速应用于寄生虫病领域，并取得良好效果。

近年来，研究者根据弓形虫SAG1基因、529 bp高度重复序列，分别设计两对特异性引物，不断优化反应步骤和实验条件，成功构建了LAMP法。在建立LAMP技术的基础上，对人血清和人工接种动物肌肉组织弓形虫感染情况进行检测，并与常规PCR法、ELISA法进行对比分析，结果发现LAMP法的最低检测限比传统PCR提高了100倍，且与其他人体常见寄生虫及原虫无任何交叉反应现象，还可弥补ELISA 法仅检测弓形虫抗体而无法确诊的不足[35-36]。此外，LAMP法也被应用到猪弓形虫病的诊断。在建立猪弓形虫病LAMP检测体系的基础上，对猪血液样本进行检测，结果发现LAMP法具有极高的敏感性，且与常见病原体没有交叉反应，能够作为判断家畜是否感染弓形虫的分子检测手段[37-38]。

4 基因芯片技术

基因芯片技术又称DNA芯片技术，是将大量的探针分子固定于支持物后与待检样本杂交，依据检测探针上的杂交信号而获取待检样本的相关信息。基因芯片具有高通量、微型化、多样化和自动化等诸多优势。近年来，基因芯片技术飞速发展，并逐渐应用于医学研究领域，在疾病的诊断、药物靶点的筛选和致病基因的测序等方面得到了广泛应用，发展前景十分广阔[39-42]。

易广才[43]依据Genbank 中弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(HCMV169)、单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ)基因序列分别设计16只寡核苷酸探针，成功构建基因芯片技术，证明该基因芯片可同时检测5种致病微生物，并与荧光定量PCR法进行比较，结果基本一致。此外，研究者根据弓形虫基因和常见人兽共患病原基因作为目的基因，设计合成特异性引物及适宜探针，成功构建了液相基因芯片检测方法，并通过实验证实，该方法检测弓形虫感染具有较好的敏感性和特异性[44-45]。

5 基因测序技术

基因测序技术是鉴定目的基因最准确的方法，最早建立的DNA测序方法有两种，即Sanger双脱氧末端终止法和化学降解法[46]。人类基因组计划的实施推动了基因测序技术的发展，在第一代基因测序技术的基础上，已经发展到第二代测序技术、第三代单分子测序技术和单细胞测序技术。

郭玲玲等[47]提取弓形虫RH株速殖子总RNA，根据棒状体蛋白18基因(TgROP18)的开放阅读框设计引物，采用逆转录PCR扩增ROP18基因，并对其产物进行测序，经生物信息学分析表明，TgROP18蛋白具有良好的免疫原性，为弓形虫疫苗的研究提供基础资料。刘楠等[48]提取弓形虫总RNA，根据TgROP16基因的开放阅读框架设计引物，采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP16基因，经基因测序及生物信息学分析发现，TgROP16蛋白具有良好的抗原性及免疫原性，有望作为弓形虫疫苗候选分子。章莹等[49]成功提取了弓形虫RH株的cDNA和基因组DNA，经酶切反应、PCR扩增及基因序列测定，发现了在原核表达系统中高效表达的重组蛋白，该重组蛋白具有较好的生物学活性，可能成为弓形虫特异性药物靶标之一。

6 结 语

综上所述，核酸分子杂交技术具有特异性强、灵敏度高的优点，且可对DNA或RNA进行定性、定量检测。PCR技术及衍生的诸多新分子生物学技术，不仅提高了弓形虫病检测的敏感性和特异性，而且为弓形虫病的实验室诊断和流行病学筛查提供了强有力的技术支持。LAMP法在检测弓形虫感染方面具有快速简便、敏感性高、设备要求低等优点，应用前景良好。基因芯片技术和基因测序技术逐渐应用于弓形虫病的诊断、药物靶点的筛选等方面，其发展前景令人期待。随着分子生物学检测技术的飞速发展和不断完善，其作为一种可弥补病原学、免疫学检测不足的新方法，必将给弓形虫病的诊断提供更强有力的技术支撑。