王成功，马春月，张瑜，韩宇，李思佳，杨旭东

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

0 引言

中药水杨梅（Adina rubella Hance）属于茜草科水团花属，具有清热利湿、解毒消肿的作用。已有研究表明，水杨梅具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物学功能[1-4]，但未见其抗肝癌作用的报告。本实验观察水杨梅根乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extraction from the root of Adina rubella Hance，EARH）对人肝癌Bel7402细胞体外抑制作用，为进一步开发其抑癌成分及作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

水杨梅全草（牡丹江大药房），由牡丹江医学院药物研究中心鉴定；人肝癌Bel7402细胞株（武汉中美科技有限公司）；MTT试剂（Sigma公司），胰蛋白酶（上海生工）；胎牛血清（Gibco公司）；DOMO（Sigma公司）；Hoechst33258(碧云天生物技术有限公司)；DEME培养基（Hyclone公司）；引物核苷酸片段（上海生工）。

1.2 主要仪器

PCR仪（德国，Biometra）；荧光显微镜（日本，OLYMPUS）；CO2培养箱（日本，SANYO）；凝胶成像仪（美国，BIO-RAD）。

2 实验方法

2.1 EARH的制备

称取水杨梅根粉末1kg，用60%乙醇回流提取，提取2次，将提取液合并，离心，取上清，减压挥发乙醇，加入适量乙酸乙酯萃取，减压浓缩干燥得到2.3g EARH。

2.2 细胞培养与分组

在37℃条件下，5%+CO2，Bel7402细胞培养于10%胎牛血清的DEME培养基中。将对数生长期细胞分为4组，实验组：用培养液倍比稀释的1、2和4mg/mL的EARH。对照组：含人肝癌Bel7402的DEME培养液。

2.3 MTT实验

取处于对数生长期Bel7402细胞，将细胞悬液密度调整为1×104个/mL接种于96孔板，每孔接种100μL。按照2.2分别加入相应剂量的EARH，每个剂量设12个平行孔，分别培养12、24和48h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，孵育4h后，吸弃培养液，向每孔中加入DMSO 150μL。酶标仪于波长490nm处，测定吸光度值（OD值），将测得的OD值代入公式计算细胞生长抑制率（inhibition rate，IR）。IR=（对照组OD-实验组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。……