桂 馨， 石嘉豪， 汪贵英， 邢丽波， 陆东东

（同济大学生命科学与技术学院，上海200092）

0 引 言

分子生物学是从分子水平研究核酸等生物大分子的结构、功能及其在生命现象中体现的重要性和规律性的科学，是一门实验性极强的学科，其理论与实验方法已经渗透到生命科学研究的各个领域［1-3］。分子生物学实验作为生命科学和医学专业重要的实验课之一，在我国多数学校均作为一门必修课程。我院将分子生物学实验操作作为本科生毕业技能考核的重要标准之一，多年来分子生物学实验课时安排为每届本科生34 学时，共包括6 个实验项目，项目设计从简单的验证性实验到综合设计性实验层层深入［4］。近年来结合本学科的发展对实验项目进行了调整，设计了“通过报告基因检测细胞内cAMP 水平变化”“哺乳动物细胞的基因转染”等实验项目。其中尤以“报告基因检测”实验较为复杂，难度较高，该实验涉及报告基因载体质粒构建、细胞报告基因转染、报告基因表达产物鉴定等多个环节［5］。特别是本实验中接触到多种实验技能，如细胞培养的无菌操作技术、细胞传代培养技术、细胞计数、质粒的脂质体转染技术、蛋白浓度测定方法、报告基因的检测技术和生物统计学分析等。

然而，由于实验学时和操作时间的限制，学生要参与所有过程是困难的，所以大部分实验由教师提前准备，学生仅完成课堂实验部分内容，几乎达不到整个实验的50%教学内容。为了让学生能够得到更多的实验技能训练和了解整个实验的技术路线，从拓展实验教学的角度出发，以“报告基因检测”实验为例，让学生参与到整个实验过程，从而培养学生的操作技能和研究思维能力［6］。

我院从以下几方面对实验教学进行了探索，通过建立精品实验项目，力求以点带面将分子生物学实验打造成实验“金课”［7］。

1 开放实验室，让学生全过程参与实验操作

鉴于原有的实验过程受实验学时的限制，学生只能操作其中的几个步骤，随着学校大力提倡在课余时间给本科生开放实验室，为了让学生有更多的时间参与到完整的实验教学过程中，引导学生在课余时间系统掌握实验课内容［8］，利用教学实验室的开放机制，让学生利用课余时间进入实验室，在老师的指导下完成所有的实验过程［9-10］，增加学生实验操作的机会，增强学生实验操作技能，牢固掌握相关的实验原理。

实验室开放前，仅对“报告基因的测定和统计分析”实验规定由学生操作，其他如细胞培养、细胞计数、报告基因质粒的转染、转染效率的分析、细胞激活剂处理、报告基因的测定和统计分析等多项实验环节基本都由教师操作，改进后所有实验环节均由学生操作。

学生通过亲自参与各个实验步骤，掌握实验操作的每个细节，拓展了学生的操作技能。对于“报告基因检测”实验，还进行了如下的改进：① 课堂教学前1周，开始进行教学相关实验技术的训练（建立无菌操作观念，掌握包括灭菌、细胞传代培养等）。②课堂教学前两天，对实验用的细胞进行计数及分组（掌握细胞计数方法及稀释方法）。③ 课堂教学前1 天，对实验用的细胞进行报告基因质粒的转染（需耗时6 h）（掌握质粒转染的技术）。④课堂教学当日清晨，让学生亲自加入激活剂。⑤ 课堂教学课上进行报告基因的测定和统计分析并完成实验报告。

通过这样的实验安排，使学生对实验室过程有了充分的了解。①原来学生没有掌握细胞培养技术，对细胞的状态、培养基的使用等没有感性认识，通过试验后，学生能正确配制细胞培养液，对细胞生长的健康状况有了初步的直观认知和判断，加深了细胞培养无菌操作的理念理解，熟悉了细胞传代培养的每个步骤。②原来学生对于报告基因检测只认为在老师转染好的细胞中加入底物上机检测就完成实验了，但是对细胞中报告基因如何进入细胞，如何发挥作用都不了解。通过改进，学生能够通过计数来调节细胞浓度然后传代细胞，能根据细胞的浓度来调整质粒的用量，并通过荧光显微镜判断分析转染的效率，如何使用激活剂并了解报告基因的处理和数据分析方法。对整个实验过程有了系统性的了解与认识。

2 优化实验，提高实验准确性

充分利用仪器设备资源，优化实验方法，提高数据精确性［11］。依托本院实验教学中心以及大型仪器公共实验平台的设备资源，通过实验室对本科生开放的机制，让学生可以自主选择对实验前后的拓展实验。通过使用更新升级的仪器设备（见图1），尝试不同试验数据的检测方法，优化实验方案，全面渗入实验课程每个细节。

2.1 检测蛋白浓度方法改进

原实验用721 分光光度计通过紫外吸收（OD280 nm波长）法来测定蛋白浓度，现在改用更精确灵敏的BCA法，同时配置了高效快速的多功能酶标仪来测定实验结果，使实验结果更精准。

2.2 增加通过转染带荧光标签的质粒判断转染效率

通过倒置荧光显微镜观察质粒转染情况，并通过拍照及软件分析判断荧光质粒转染效率，增加收集一项实验数据，更精确地判断报告基因的转染效率。

2.3 改变细胞计数方法

原有计数方法是通过血球计数板人工计数，耗时较长，通过购置全自动细胞计数仪，能快速准确地实现细胞计数，缩短了实验时间，提高了实验效率。

图1 实验中使用的部分仪器图

3 优化实验设计，拓展实验深度和广度

3.1 调整实验中试剂加入量

在每个实验中，试剂加入量的准确使用是实验成功的关键，所以，调整实验中的试剂加入量，作为预实验要确定的一个重要指标。例如，报告基因检测实验中需要用激活剂对细胞进行处理，升高细胞内的cAMP水平，不同处理时间会有不同的结果，通过学生自行设计选择不同的试剂浓度、处理时间，得到不同的实验结果。再根据实验结果找出最合适的激活剂计量，使实验在计量上更精确。最后通过学生对实验数据的分析处理，得出最佳的处理时间。这样每组学生的实验报告数据都是不同的，提高了学生对实验探索的兴趣。

3.2 扩充细胞种类

实验中研究对象的选择为实验结果的分析提供了很好的依据，因为假如在一种细胞中没有实验结果，可能在另一种细胞中获得满意的结果，从而提高了学生分析实验结果的能力。以本实验为例，从细胞传代培养开始实验教师提供几种不同的肿瘤细胞供学生选择，除了在实验讲义上使用的293T（人胚肾细胞），增加了CNE（人鼻咽癌细胞）、4T1（小鼠乳腺癌细胞）、A549（人非小细胞肺癌细胞）、Hela（人宫颈癌细胞）等多种肿瘤细胞供学生选择使用。不同的细胞转染效率不同（见图2），实验结果也不同，这种带有探索性的实验过程，虽然以实验讲义中的实验步骤为主干，却大大提高了实验的自由度，也激发了学生科学探索的欲望，有利于学生掌握相关实验技术，加深理解实验涉及的分子生物学原理。

4 结 语

在教学过程中实验产生的数据，一般要求每个学生对结果进行处理分析并详细讨论。数据越丰富，学生讨论得越深入。在本实验中，由于每组同学使用的细胞和实验相关试剂及药物处理时间的不同，每组学生得到的实验结果都不尽相同，学生不仅可以就本组的数据进行分析，亦可横向联合多组数据进行比较、总结。增加了数据总结环节的挑战性。通过这一过程，促进学生对相关知识点的综合学习和应用，加深对已掌握的理论知识的理解，全面提高学生的自觉动手能力，拓宽视野，丰富思维，将知识融会贯通，从而得到较全面的科学分析与技能训练，培养学生科学实验素质和综合实验的能力［12-13］。

图2 不同细胞转染效果荧光显微镜图片

我院分子生物学实验课程至今已开设16 年，逐渐形成了较稳定的主讲教师、实验辅助老师以及助教教学队伍。实验条件近年来也得到极大提高，教学方法密切结合学科特点，受到学生和督导老师的一致好评。

报告基因检测技术，是一种间接的测定技术，涉及报告基因载体质粒构建、细胞转染、报告基因产物测定等环节。萤光素酶检测系统是一个先进指示系统［14］，操作简便，灵敏度高，辉光型信号亮且持久，可用于因灵敏度不够而受限的挑战性应用。通过本精品实验项目将报告基因检测技术介绍给学生，有一定的独创性。通过实验全面提升学生对于分子生物学基础知识的理解，训练学生综合实验的能力［15］。

同时由本实验项目提出实验相关的问题启发学生思考讨论，更进一步依托本院教学实验中心的实验室空间和设备资源开辟延伸课堂，通过实验室开放机制，鼓励学生自主选择对实验前后的拓展实验、试剂准备、实验操作、仪器设备使用、实验优化等方面介入实验过程每个细节，建立该实验项目的延伸课堂体系。并在实验教学中引导学生积极思考、训练其思维能力、动手能力和分析能力。通过实验报告评估，动手能力评价，实验重复性好坏，以及问题分析和解决方案的拟定等多个方面对学生进行综合考核。使学生逐步形成以自主式、合作式、研究式相结合的学习方式，激发学生兴趣，锻炼科研思维，培养运用科研思维和系统组合各种实验技术来实现科研目标的能力。