方 涛 闫 京 张 明 赵加力 潘 伟 王新宏 周 全

(徐州医科大学附属淮安医院骨科，江苏省淮安市 223002，电子邮箱：wuque197928@163.com)

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在恶性肿瘤中被激活，可调控肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和化疗耐药[1]。我们在前期研究中发现mTOR信号通路在人骨肉瘤组织中被激活，且该通路患者的生存期、骨肉瘤对术前化疗药物的反应等密切相关[2]。近年有学者发现mTOR在肿瘤干细胞的干性维持中发挥作用[3]，但其在骨肉瘤干细胞的干性维持中的具体作用尚不清楚。雷帕霉素是mTOR信号通路的特异性抑制剂，本研究旨在探讨mTOR在骨肉瘤干细胞中的表达，以及雷帕霉素对骨肉瘤干细胞增殖和干性维持的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂、仪器 人骨肉瘤U2OS细胞购自上海佰晔生物科技公司；雷帕霉素胶囊购自华北制药股份有限公司(批号：181001；规格：1 mg/粒)；兔抗人CD133多克隆抗体(批号：10180423)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)抗体(批号：0920108)和SRY盒转录因子2(SRY-box transcription factor 2，Sox2)抗体(批号：1804227)均购自美国Santa Cruz公司；RIPA裂解液购自武汉博士德公司(批号：180101)；FC型酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；Isolex 300i细胞分选仪购自Nexell公司；LabWorksTM凝胶成像及分析系统购自美国UVP公司。四甲基偶氮唑蓝比色法试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司(批号：1603211)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养：将U2OS细胞培养于含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基中，将培养基放置于37℃、5 % CO2、饱和湿度培养箱中培养，每1～2 d更换培养基一次。当细胞生长到覆盖瓶底壁80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，传代后继续放置于培养箱中。取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 免疫磁珠法分离CD133+U2OS细胞：取对数生长期的U2OS骨肉瘤细胞，4℃下1 200 r/min离心4 min，弃去上清液，以3 mL含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)重悬细胞，制成细胞悬液，计数1×108个细胞，加入FcR阻断试剂(Miltenyi公司，批号：130090482)和CD133磁珠试剂(Miltenyi公司，批号：130090482)，4℃孵育30 min，MACS(Miltenyi公司，批号：130042201)磁性分选柱分离CD133+细胞和CD133-细胞。

1.2.3 四甲基偶氮唑蓝比色法检测CD133+U2OS细胞的增殖抑制情况：按照文献[4]中的方法，取对数生长期的CD133+U2OS细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，分为预对照组、低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组，分别加入含0 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL雷帕霉素的杜氏改良伊格尔培养基(含10%胎牛血清)2.5 mL于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，培养24 h、48 h、72 h后，每孔加四甲基偶氮唑蓝溶液(5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h，终止培养，加入150 μL二甲基亚砜,震荡10 min，采用全自动酶标仪检测490 nm波长下的吸光度值。计算CD133+U2OS细胞的增殖抑制率(%)=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。实验重复5次。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测mTOR、p-mTOR和干性标志蛋白的表达：取对数生长期的CD133+U2OS细胞，分为对照组和雷帕霉素组。对照组使用不含雷帕霉素的杜氏改良伊格尔培养基(含10%胎牛血清)20 mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，雷帕霉素组使用含适宜剂量雷帕霉素的培养基培养48 h后，收集细胞，将细胞用4℃的PBS洗涤2次，置于冰上，加入中等强度的RIPA裂解液裂解细胞，4℃、13 000 r/min离心5 min，取上清。采用二喹啉甲酸法(试剂购自江苏凯基生物技术有限公司，批号：1804062)进行细胞总蛋白浓度测定，制备电泳凝胶，上样后进行电泳分离蛋白。电泳完毕后转膜1 h，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入按1 ∶400稀释的mTOR(Santa Cruz，批号：1311426)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mTOR，p-mTOR;Santa Cruz，批号：1602443)、Sox2、Oct4一抗及甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(以GAPDH作为内参；Santa Cruz，批号：1501226)，37℃孵育2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(江苏凯基生物技术有限公司，批号：1810215；1 ∶300)，37℃孵育1 h。通过化学发光试剂盒 (江苏凯基生物技术有限公司，批号：1903114)显影，采用凝胶成像系统对胶片进行扫描与数据采集，每组设5个复孔。实验重复5次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，重复测量资料的比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 雷帕霉素对CD133+U2OS细胞的增殖抑制作用 预对照组CD133+U2OS细胞的增殖抑制率均为0。低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组CD133+U2OS细胞的增殖抑制率比较，差异有统计学意义(F组间=42.761，P组间<0.001)，两组细胞的增殖抑制率均有随时间变化的趋势(F时间=4 988.486，P时间<0.001)，分组与时间有交互效应(F交互=13.684，P交互=0.004)。其中，两组干预48 h后的细胞增殖抑制率均较干预24 h增高(均P<0.05)，而干预72 h后与干预48 h后的增殖抑制率差异无统计学意义(均P>0.05)；高剂量雷帕霉素组干预24 h、48 h和72 h后的增殖抑制率均高于低剂量雷帕霉素组。见表1。因此，在后续的实验中我们选择了采用高剂量的雷帕霉素干预48 h(雷帕霉素组)。

表1 两组CD133+U2OS细胞的增殖抑制率的比较(x±s，%)

2.2 雷帕霉素对CD133+U2OS细胞mTOR的表达及其磷酸化的影响 雷帕霉素组CD133+U2OS细胞中mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量均低于对照组(均P<0.05)。见图1和表2。

图1 两组CD133+U2OS细胞中mTOR及p-mTOR的表达情况

表2 两组CD133+U2OS细胞中mTOR和p-mTOR相对表达量的比较(x±s)

2.3 雷帕霉素对CD133+U2OS细胞干性标志蛋白表达的影响 与对照组相比，雷帕霉素组细胞Sox2和Oct4蛋白相对表达量均下降(均P<0.05)。见图2和表3。

图2 两组CD133+U2OS细胞中Sox2及Oct4的表达情况

表3 两组CD133+U2OS细胞中干性标志蛋白相对表达量的比较(x±s)

3 讨 论

有多项研究显示肿瘤细胞的干性维持在肿瘤的发生和发展、化疗耐药等方面具有重要作用[5-7]。肿瘤干细胞是近年来研究的热点之一，它具有干细胞的特点，即自我更新、无限增殖及分化潜能，在启动肿瘤形成和生长中起决定性的作用；同时，其还具有增强DNA修复能力、上调ABC转运蛋白表达水平等作用[8]。以上作用导致骨肉瘤干细胞在化疗中可能通过自我更新、无限增殖等特性逃避化疗的毒性作用，引起化疗多药耐药，导致复发转移[8]。作为一种能够无限自我更新且具有一定分化潜能的细胞，肿瘤干细胞维持自我更新和多项分化潜能(即干性维持)的机制非常复杂，其确切机制目前仍不清楚。

CD133是多种实体肿瘤干细胞共同的表面标志物，CD133+肿瘤细胞较CD133-肿瘤细胞具有更高的自我更新能力和体内成瘤能力[9]。我们在前期的研究中也已发现CD133+骨肉瘤细胞具有较强的自我更新、多向分化及体内成瘤能力，且其干性标志蛋白的表达更高，具有肿瘤干细胞的特点[10]。因此，我们分离出CD133+U2OS细胞进行干性维持研究。本研究结果显示，经雷帕霉素干预后，CD133+U2OS细胞的增殖受到了抑制，同时细胞中的干性标志蛋白Sox2和Oct4的表达也下降，提示雷帕霉素不仅可时间-剂量依赖性地抑制CD133+U2OS细胞的增殖，还可抑制细胞的干性维持。

mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶类家族成员，能调控细胞内mRNA的翻译、蛋白转运和降解，在细胞生长和代谢、肿瘤化疗耐药中起重要的作用，阻断mTOR通路可以起到包括抗骨肉瘤在内的广泛抗肿瘤作用[1]。我们的前期研究的结果显示，mTOR/p70S6K信号通路高表达的骨肉瘤患者的预后显著差于低表达的骨肉瘤患者，且该信号通路的高表达与骨肉瘤的化疗耐药、远处转移等相关[2]。此外，mTOR信号通路在骨肉瘤干细胞中被激活，并调控骨肉瘤干细胞的化疗耐药[11]。近年来有研究显示mTOR通路参与了肿瘤干细胞的干性维持[3]。本研究结果显示，经雷帕霉素干预48 h后，CD133+U2OS细胞的mTOR和p-mTOR的相对表达水平较对照组下降，提示雷帕霉素可以有效地抑制CD133+U2OS细胞中的mTOR信号通路。由此推测，mTOR可能在CD133+U2OS的干性维持中发挥重要作用，且这种作用可以通过雷帕霉素进行抑制。

综上所述，雷帕霉素能够抑制人骨肉瘤CD133+U2OS细胞的增殖和干性维持，这可能与其下降低mTOR信号通路活性有关。