郭成栓，杨桂玲，刘晓珊

(广东食品药品职业学院生物技术学院，广东 广州 510520)

纤维素酶包括β-葡聚糖外切酶、β-葡聚糖内切酶和纤维二糖酶[1-3]。纤维素酶通常在酸性条件下发挥其催化作用，在碱性条件下酶活较低甚至没有，从而限制了其在碱性环境中的应用。碱性纤维素酶是一种缺少β-葡聚糖外切酶和纤维二糖酶的非全纤维素酶组分的β-1,4-葡聚糖内切酶，不会破坏纤维素的结构，可以在碱性条件下发挥催化作用,被广泛应用于洗涤剂、脱墨等行业[4-6]。洗涤剂中加入碱性纤维素酶，一方面可增强洗涤剂的去污能力，有效去除棉织物上的污垢；另一方面还能对棉织物起到保护作用，避免变黄、变硬，使颜色鲜艳并保持柔软。分离碱性纤维素酶基因、构建基因工程菌是提高碱性纤维素酶产量的重要方法之一[7-9]。此外，酶分子的定点突变和定向进化也为酶分子的改造提供了新的思路[10-13]。酶分子体外定向进化模拟自然进化，通过酶编码基因的一轮或多轮突变，构建酶突变基因文库，经过筛选得到所需性质的酶[14-15]。定向进化的方法主要有易错PCR、DNA shuffling等，根据待进化的酶分子特性可选择不同的方法。作者根据阳性转化子在IPTG诱导下可以在LB-CMC平板上产生水解圈的原理[16-17]，在初筛和摇瓶复筛的基础上，采用易错PCR法对β-1,4-葡聚糖内切酶基因进行定向进化，从阳性转化子中筛选酶活提高的突变菌株。

1 实验

1.1 试剂与仪器

PCR产物纯化试剂盒、IPTG，上海生工；胶回收试剂盒，Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、DNase Ⅰ、XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RNase A、dNTPs、DNA抽提试剂，大连宝生物公司。……