步洪石，王仁广，胡力铭，赵天倚，王 檀，王淑敏※

（1.长春中医药大学，吉林长春130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林长春130021）

2020年1月，中国科学家首次鉴定出导致重症肺炎的新型冠状病毒即2019-nCoV[1]。2019-nCoV属于属的新型冠状病毒，主要传播途径为呼吸道飞沫和接触传播，人群普遍易感，根据目前的病理观察，对肺脏、脾脏、心脏、肝脏和肾脏等多组织器官皆有损害的可能[2]，治疗手段一般为支持治疗及服用抗病毒药物等，炎症因子风暴在普通型患者转重症的过程中起到了推波助澜的作用，加重了器官损伤程度。

“除湿防疫散”是吉林省抗击“新冠肺炎”轻症期的有效方剂，在临床上发挥了重要的作用。该方是经典名方《平胃散》的变方，由苍术（15 g）、陈皮（15 g）、厚朴（10 g）、炙甘草（5 g）、干姜（5 g）和大枣（5 g）组成，具有除湿运脾、温中和胃、扶正辟疫的功效，用于肺脾气虚患者改善身体状态，提升人体防御（湿）疫毒侵袭的能力。本研究以网络药理学方法探讨除湿防疫散预防新型冠状病毒肺炎感染的作用靶点与机制，预测防治机理，为临床施用提供参考。

1 材料与方法

1.1 除湿防疫散中化合物及靶标蛋白筛选

借助中药系统药理分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com）[3]，分别以“苍术”、“陈皮”、“甘草”、“生姜”、“大枣”和“厚朴”为关键词搜索并筛选符合口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%且类药性指数（Drug-like，DL）≥0.18的化学成分作为活性成分，并得到相关靶标蛋白。

1.2 靶标基因名转换及药材-化合物-靶标网络的构建

借助Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库对靶标蛋白进行对应的基因名转换，并使用Cytoscape3.7.2软件构建药材-化合物-靶标网络。

1.3 蛋白互作（PPI）网络构建

利用STRING 11.0（https://string-db.org/）平台对靶标进行蛋白互作分析，Organism设定为人（Homo sapiens），将最低要求互作值（minimum required interaction score）设置为最高，隐藏无连接靶点，输出TSV格式文件，导入Cytoscape进行Network Analyzer，分析规则为节点的大小、边的粗细分别按照度值由小到大递增，节点及边的颜色分别按度值及综合评分递增，由冷色到暖色渲染。

1.4 靶点的基因本体及通路富集分析

为了进一步了解1.2筛选出的靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将所得除湿防疫散的作用靶点导入metascape数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）[4]，该库整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等多个数据库，数据更新快，可完成通路富集和生物过程注释，上传靶基因名称列表文本文档，限定物种为人，gene ID转换后，进行GO生物学过程注释、聚类分析和KEGG通路富集分析，将所得KEGG分析结果前20个条目进行P值转换，以符合标准上传格式，运用Omicshare绘图云平台（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble）对其结果进行气泡图绘制。

1.5 分子对接

结合现有分子对接研究筛选“2.1”节关键化合物，选择尚未进行对接研究的化合物与血管紧张素转化酶II（ACE2）和SARS-CoV-23CL水解酶进行分子对接；通过PubChem查询相应化合物结构，保存为SDF格式，导入Chem3D软件优化空间结构，使能量最小化，保存为mol2格式，导入分子对接软件AutoDock Tools1.5.6 进行加氢，计算电荷及加root操作后保存为pdbqt格式文件。从蛋白质数据库PDB（https://www.rcsb.org/）下载SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2的三维晶体pdb格式（PDB ID为6LU7和1R4L），导入Pymol软件对蛋白进行去水，去除小分子配体后，导入Auto-Dock Tools进行加氢，计算电荷后保存为pdbqt格式文件。通过AutoDock Vina 4.0进行分子对接，将最优对接结果导入Pymol进行可视化处理。

2 结果

2.1 除湿防疫散中药活性成分及靶标筛选结果

图1除湿防疫散药物-成分-靶点网络Fig.1 Dehumidification and anti-epidemic powder drug-component-target network

TCMSP数据库对除湿防疫散组方进行检索共得到活性成分102个，其中苍术4个，陈皮4个，大枣12个，甘草76个，生姜4个，厚朴2个，柚皮素（naringenin）为陈皮和甘草共有成分，槲皮素（quercetin）、丁子香萜（Mairin）为大枣和甘草共有成分，-谷甾醇（beta-sitosterol）及豆甾醇（Stigmasterol）为大枣和生姜共有成分；活性成分对应靶点1613个，剔除重复最终获得97个活性成分、227个靶点。Cytoscape构建所得药材-成分-靶点网络见图1，内圈绿色为药物，蓝色为成分，外圈黄色为靶点。拓扑网络分析得到度值前5位的成分为MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000173（汉黄芩素）、MOL004328（柚皮素）和MOL003896（7-甲氧基-2-甲基异黄酮），对应度值分别为137、86、76、70和60。

2.2 PPI网络构建结果

通过STRING 11.0平台对组方靶点分析，获得PPI网络图。网络统计节点数量共226个，边数量897条，平均节点度7.94，PPI富集P＜10-16，平均局部聚类系数0.439。通过Cytoscape对PPI网络进行Network Analyzer得到图2，以度值排序得到交互作用较多的靶标前10个为SATA3、JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK 14、CXCL 8、FOS和EGFR。SATA 3、JUN、FOS、MAPK和EGFR系列为癌基因，涉及细胞发育分化等，有研究表明，SATA3表达与肿瘤的生物学特征均有一定关系，SATA3的激活可能会增强扭曲蛋白（Twist）、上皮钙黏素（E-cad）在胃癌组织中的表达[5]；RELA可调控NF-B炎症信号通路系统[6]，与IL-6、CXCL8等炎症因子存在协同作用，密切联系着病毒、细菌感染患者的临床症状。

2.3 GO富集分析及KEGG富集分析

以P＜0.01，最小计数为3，富集因子＞1.5筛选得到GO富集条目共计245条，其中前20条皆为生物过程（GO，Biological Processes），涉及激素水平的调节、对酮的反应、血液循环、血管发育和细胞死亡的阳性调节等，见图3；基因功能聚类结果展示了各生物过程间的关系联接，通常使用scores作为在丰度项上进行层次聚类时的相似度度量[7]，越高表示临近调控关系越复杂，所处区域网络核心性越明显，相同大小的scores表示基因间的相似性及功能相关性很高。将score＞0.3的子树视为一个聚类，共获得21个子集，包括细胞对有毒物质、激素刺激、无机物、脂多糖、细菌起源分子、受伤、抗生素、细胞外刺激和氧化应激的反应等，见图4和图5。图4是由群集ID着色的网络，其中相同群集ID的节点颜色接近，图5是由P值着色，其中含有较多基因的项具有较显著的P值，即具有较深的着色；以P＜0.05筛选得到KEGG生物过程共计245条，其中前20条涉及癌症相关途径。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、沙门氏菌感染、NF-B信号通路、钙信号通路、p53信号通路、癌症中的转录失调、卵巢类固醇生成、朊病毒病、AMPK信号通路和PPAR信号通路等，见图6。

图2 PPI网络分析Fig.2 PPI network analysis

图3 GO富集分析前20条条目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

图6 KEGG通路富集分析前20条条目Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis

2.4 分子对接结果

因槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、柚皮素与SARSCoV-23CL水解酶和ACE2的分子对接已有相关研究[8]，故选择7-甲氧基-2-甲基异黄酮（MOL003896）作为配体进行分子对接。当分子与受体稳定结合时，结合能（binding energy）越低，发生作用的可能性越大，结果显示，MOL003896与SARS-CoV-23CL水解酶最小结合能为﹣6.1 kJ/mol，MOL003896与ACE2最小结合能为﹣8.4 kJ/mol，皆具有稳定的结合表现。核心化合物MOL003896与SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2对接模式见图7和图8。

图7 MOL003896与SARS-CoV-2 3CL的对接模式图Fig.7 MOL003896 and ACE2 docking mode diagram

3 讨论

此次COVID-19以“寒、湿、瘀、虚”为主要病机特点，寒湿犯脾则邪毒易侵，除湿防疫散是平胃散的变方。刘瑶等[9]研究表明，平胃散可改善湿困脾胃证大鼠疲劳状态，提高血浆肝糖原含量；李建等[10]研究表明，针对脾虚痰浊阻滞证痛风患者，平胃散合桂枝芍药知母汤能够减少痛风发作次数，降低尿酸水平，并减轻IL-1、IL-8等炎症因子的反应。有相关文献验证[11]，PPI网络分析得到的AKT1、IL-6、MAPK3等主要靶点，干预了COVID-19临床治疗中期阶段。基因本体分析及通路富集分析结果展现了除湿防疫散对多种疾病具有潜在治疗作用，最显著的是对癌症及肿瘤相关通路（p53信号通路，Wnt信号通路）的作用，对于细菌感染及朊病毒感染亦有效果。此外，还涉及多个炎症及代谢相关信号通路的干预，如NF-B通过刺激因子（病毒、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子和淋巴毒素等）的活化诱导相关靶基因的表达而产生多种细胞因子参与炎症反应[12]。Ma等[13]研究发现，抗病毒作用可通过TLR4/NF-B信号通路相关炎性细胞因子的下调表达来实现；PPI网络得到的核心靶点AMPK能通过调节氧化应激、抗炎等途径减轻肺部相关疾病症状，如哮喘、肺部感染和肺损伤等[14]；PPAR在炎性细胞、肿瘤细胞、呼吸道上皮、支气管黏膜下层和呼吸道平滑肌均有表达，有抑制炎症、诱导细胞分化、抑制增殖和诱导凋亡等作用[15]。有分子对接相关文献报道[8]，拓扑网络分析得到的核心化学成分槲皮素、山柰酚、汉黄芩素和柚皮素等，与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的结合能力优于临床推荐用药，经分子对接验证的7-甲氧基-2-甲基异黄酮（MOL003896）与ACE2及SARSCoV-23CL水解酶具有较好的对接活性，进一步体现了除湿防疫散针对COVID-19具有临床治疗潜力。综上所述，除湿防疫散发挥抗病毒作用，一方面通过健脾利湿，扶正辟疫，提升脾虚湿滞患者抵抗外邪的能力，另一方面可能通过上述AKT1、IL-6、MAPK等靶点及NF-B、AMPK等炎症代谢通路，抑制COVID-19过程中炎症因子风暴的产生，起到抗病毒的作用。

有研究对新型冠状病毒的传播潜力进行了预估[16，17]，国内疫情状况于6月出现转暖，我国通过采取一系列预防控制和医疗救治措施，境内疫情上升的势头得到了有效遏制。病毒起源尚未确定，其传播能力不容小觑。中医中药作为传统医学，千百年来保障着中国人的身体健康，是抵御多次重大疫情的强力工具。针对COVID-19，国家卫健委已修订发布了多版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，各省、市也相继出台了以中医药治疗为手段的解读方案，体现了中医药在COVID-19治疗过程中至关重要的作用。针对此次冠状病毒的预防，中医始终提倡“治未病”[18，19]，包括未病先防、欲病救萌、既病防变和瘥后防复4个层次，尤其是针对易感人群，治未病原则显得尤其重要。《黄帝内经》有载：“正气存内，邪不可干”，此次COVID-19中不乏年迈体弱的危重患者，该群体自身体质虚弱，多患有老年病及并发症，免疫功能低下，易受病毒疫邪侵扰。除湿防疫散可调节机体环境，提升抵抗病毒的正气，最终实现防病治病的目的。