郭伟娜， 张 瑞， 王雨欣， 卫文娟， 曾凡俊， 赵 磊

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌(

Pasteurella

multocida

，Pm)感染禽类引起的一种接触性传染病，死亡率较高，在家禽生产中造成严重经济损失。虽然可以用疫苗免疫和药物治疗防控该病，但由于各种应激因素导致禽霍乱与其他细菌病的发病率和死亡率不断增加。在不同地区不同血清型的Pm菌株致病性和药物敏感性有明显不同，对禽类的易感性也有差异。可感染禽类的Pm荚膜血清型有A、B、D和F四种，其中A是最主要的血清型：上埃及不同地区275个家禽中分离的21株Pm中有18个菌株为A血清型，3个为D血清型；程龙飞等从福建及邻近省份分离95株禽源Pm均为A血清型；陶娅等从禽霍乱病例中分离的12株Pm也均为A血清型。Pm的分离鉴定除了传统分离培养和生化鉴定外，PCR方法用于Pm的荚膜分型和鉴定更快速、重复性较好。近年来，采用全基因组测序和系统进化分析进行Pm鉴定，有利于深入了解不同分离菌株间的关系，同时对Pm外膜脂多糖结构提供更详细的信息，从而为筛选菌株制备灭活疫苗提供重要参考。细菌致病性是由多种毒力因子共同参与的结果，深入研究各毒力因子特性有助于筛选高免疫原性蛋白用于亚单位疫苗的研发。Pm的毒力因子主要有黏附素、荚膜、外膜蛋白、脂多糖、皮肤坏死毒素、铁调节蛋白、溶血素、唾液酸酶、透明质酸酶等。其中

ompH

、

oma

87、

plpB

、

psl

、

ptfA

、

exbD

、

tonB

、

fur

、

hgbA

、

nanB

、

sodA

、

sodC

等11个毒力因子相关基因在禽源Pm菌株中的检出率高于90%。有研究发现从15个感染人体内分离到的多杀性巴氏杆菌和猫源分离菌株有共同的毒力基因类型和药物敏感性，说明家猫可能是Pm的潜在贮存宿主。因此，多杀性巴氏杆菌病的防控在公共卫生方面具有重要意义。本研究主要对安徽省某养殖户送检的病死草鸡进行Pm的分离鉴定及其毒力基因的检测，以期为Pm的致病性研究及防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

PCR Master Mix、DL-2000 DNA Marker、5×TAE缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司，血琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司，普通营养琼脂和麦康凯琼脂培养基为实验室自行配制。

1.2 样品采集

安徽省五河县某养殖户送检的6只50日龄病死草鸡，临床剖检，气管充血，肝脏出现大量白色坏死点，脾坏死，十二指肠出血，心外膜和心内膜出血。

1.3 分离纯化

采集病死鸡的肝脏组织在普通培养基、麦康凯琼脂和血琼脂培养基上分别划线，进行病原菌分离，于37 ℃培养24 h，挑选符合Pm菌落特征的单个菌落进行纯化，纯化后的细菌进行革兰染色和镜检。

1.4 DNA模板制备

取分离菌的纯培养物溶解在50 μL无菌超纯水中，100 ℃煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 rpm离心5 min，离心后弃去沉淀留存上清液。

1.5 引物合成

细菌16S rRNA的通用引物和Pm荚膜A血清型的引物序列参考文献[2]，由通用生物系统(安徽)有限公司合成引物。

1.6 16S rRNA和capA基因PCR检测

以煮沸法提取的分离菌核酸为模板，PCR扩增16S rRNA和

capA

基因。反应体系采用50 μL：ddHO 19 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL。反应条件见表1。取5 μL PCR产物电泳检测，将有目的条带的样品寄至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序分析。

表1 PCR反应条件

1.7 毒力基因PCR检测

参考相关文献Pm的23个毒力基因(

ptfA

、

fimA

、

nanH

、

hsf

1、

hsf

2、

tbpA

、

pmHAS

、

pfhA

、

tadD

、

toxA

、

sodA

、

sodC

、

ompA

、

ompH

、

oma

87、

plpB

、

exbB

、

exbD

、

tonB

、

hgbA

、

hgbB

、

Fur

、

nanB

)引物序列，由通用生物系统(安徽)有限公司负责合成引物。PCR反应体系如1.6，反应条件见表2。PCR产物的检测及测序分析见1.6节。

2 结果与分析

2.1 分离培养及染色结果

在血琼脂培养基上的菌落特征为光滑、湿润、半透明、露滴状、灰白色的圆形小菌落，但在另外两种培养基上不生长，与Pm的培养特点一致。分离菌的革兰染色镜检结果为两极浓染的红色短杆菌(图1)，符合Pm的染色特征。

图1 分离菌的染色镜检结果(×1 000)

2.2 PCR扩增及测序结果

该分离菌16S rRNA和

capA

基因的PCR扩增结果见图2。其中16S rRNA基因序列与Pm参考菌株(GenBank登录号：CP033597)的同源性为99.86%，

capA

基因序列与Pm参考菌株(GenBank登录号：CP048792)的同源性为100%。

图2 16S rRNA和capA的基因PCR扩增结果

2.3 毒力基因PCR扩增及测序分析结果

23个毒力基因的PCR扩增结果见图3，除

nanH

、

toxA

和

nanB

之外，共检测出20个毒力基因，其测序结果与Pm菌株对应毒力基因的同源性位于98.11%～100%之间，详见表2。

图3 毒力基因的PCR扩增结果

表2 毒力基因同源性比对结果

3 结论与讨论

本研究从安徽蚌埠五河养殖户送检的病死草鸡肝脏中分离鉴定出一株荚膜A血清型的Pm，通过16S rRNA基因的PCR扩增及测序方法进行病原菌分离鉴定。相对于细菌传统分离鉴定方法存在耗时长、操作繁琐等缺点，分子生物学方法比如PCR技术和核酸技术的发展和完善，使分子检测更准确快速、操作方便、检测量大，适用于临床病原菌的分型鉴定。目前，采用PCR扩增鉴定病原菌的方法很多，多数致病菌的16S rRNA基因序列已被报道。

Pm的致病性与荚膜等毒力因子相关，毒力因子通过破坏宿主的组织和防御系统同时激发炎症反应，促进该菌侵袭和定殖。荚膜是营养物质进入和离开的必要通道，具有抗干燥、促进黏附和定植、避免宿主吞噬和补体介导的杀伤等作用。脂多糖(LPS)是一种保护性抗原，有助于Pm的黏附定殖，躲避宿主先天免疫。有文献报道

fimA

、

pfhA

和

ptfA

等黏附素相关基因在Pm中携带率较高，本研究也检测出了

fimA

、

pfhA

和

ptfA

这3个毒力基因，其与 Pm参考菌株对应基因的同源性分别为99.52%、98.95%和99.79%，但有文献检测鸡源Pm菌株毒力基因未检出ptfA基因。Pm所含的铁摄取相关蛋白和外膜蛋白等在病原菌感染过程中也发挥重要作用，本研究从Pm分离菌中分离出了

exbB

、

exbD

、

tonB

、

hgbA

、

Fur

等铁摄取相关蛋白和

ompA

、

ompH

和

oma

87等外膜蛋白基因，这与其他文献报道一致。

由于Pm感染对畜禽养殖业造成的危害巨大，因此，养殖场应建立严格的管理制度，及时检疫尽早发现病禽以及消毒是防控该病的主要措施。该病的治疗主要依赖于抗菌药物，具体的用药原则还需参考药敏试验结果。同时该病防控还应结合疫苗免疫接种，但由于Pm血清型有5个，彼此交叉保护性较弱，因此，非常有必要了解某地区Pm菌株的血清型及流行情况，为该病的致病性研究及防控提供参考依据。