李梦媛杨星九张文龙李维莎曹 琳刘宏飞高 苒

(中国医学科学院医学实验动物研究所,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100121)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是hnRNPs 家族成员之一,其基因位于人第9 号染色体q21.32 ～q21.33,序列高度保守,含有3 个K 同源区(K homologue, KH),每个K 同源区由65～70 个氨基酸组成,该区域能够与RNA 和DNA 结合并相互作用[1-2]。 HNRNPK 还含有一个核定位信号(nuclear localization signals, NLS)以及一个核穿梭结构域(nuclear shuttling domain, KNS)[3]； NLS 调 节HNRNPK 从胞浆到核的转运,KNS 则通过核孔复合物调节双向穿梭[4]。 HNRNPK 特殊的分子结构使其能够参与转录调控、RNA 加工与翻译以及转录后修饰等多种细胞进程[5]。 大量研究显示HNRNPK与目前威胁人类生命的肿瘤疾病密切相关,多种肿瘤的形成和发展都与该家族蛋白有关[1]。

HNRNPK 在原发性和转移性肺癌中高表达[6],而其在多种肿瘤中的高表达通常与不良预后相关[7-8]。 然而HNPNPK 在肺癌中的具体作用机制仍然未知,需要进一步研究。 本实验构建了荧光素酶标记的由强力霉素(doxycycline, DOX) 调控HNRNPK 稳定下调的H1299 细胞株,旨在为进一步研究HNRNPK 在肺癌发生发展中的作用机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

H1299 细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 主要试剂与仪器

PBS、RPMI 1640 培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清等购自美国Gibco 公司；D-Luciferin 购自北京泛博生物化学有限公司；TRIzol 试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、购蛋白预染Marker 自Thermo Fisher 公司；SYBR green 荧光染料购自日本Toyobo公司；定量PCR 专用96 孔板购自ABI 公司；HNRNPK 抗体购自Abcam 公司；p53、p21、CCND1抗体购自CST 公司；……