李芹梅，李文祥，曹孟会，刘 松，张天谣，汪 琼，黄美娟，黄海泉

（西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南 昆明 650224）

0 引言

【研究意义】凤仙花属（ImpatiensL.）植物以花色多样化和具有两侧对称花为主要特征，被认为是“双子叶兰科植物”[1]。滇水金凤（Impatiens uliginosa）是凤仙花科的一年生或多年生植物，其花形奇特，花期长，适应性广，具有很高的观赏价值[2]。关于滇水金凤研究主要集中在花色及花发育调控基因克隆[3-4]、叶绿体全基因组[5]和金属元素测定[6]等，目前缺少非生物胁迫，尤其是重金属胁迫下滇水金凤花色的变化研究。因此，本研究以滇水金凤为试验材料，探讨不同含量Cu2+对其花色及各生理生化指标的影响，有助于进一步为滇水金凤的新品种选育提供参考依据。【前人研究进展】花色是观赏植物重要特征之一[7-8]。花颜色是由多种因素共同决定的，如色素种类及含量、液泡pH值、共色素、金属离子含量等[9-10]。其中花色苷成分和含量是影响花色最重要的因素[11]，吴艳梅等[12]认为花色苷成分影响红色丽格海棠（Rieger Begonia）花色深浅；江洁蓓等[13]认为花色苷含量是影响粉红珙桐（Davidiainvolucrata）花色关键因素。目前金属离子对花色的影响仅集中在少数金属对指定植物。如，Ito等[14-15]发现Al3+、K+、绣球蓝复合物和共色素分布在绣球花（Hydrangea macrophylla）萼片组织中从而形成蓝色萼片；Takeda等[16]发现Fe3+、矢车菊素-3-5-葡萄糖苷和黄酮醇络合为共色复合体形成蓝花矢车菊（Centaurea cyanus）；Yoshida等[17]研究发现大绿绒蒿（Meconopsis horridula）的黄酮醇与Fe3+、Mg2+作用导致其花瓣呈蓝色；李荣华[18]发现红色新几内亚凤仙花（Impatiens hawkeri）花色受Cu2+、Al3+影响发生了改变。此外，基础代谢物含量对花色影响也引起了研究者们关注，植物体内重要基础代谢物是可溶性蛋白、脯氨酸和作为花色苷合成的前体和信号物质的糖，这些物质含量变化均会影响花瓣呈色[13,19]。【本研究切入点】课题组前期对铜胁迫下滇水金凤的生理响应和富集特征研究发现，不同含量Cu2+处理下滇水金凤花色发生明显改变，肉眼观测到花色随Cu2+含量增加花色逐渐变淡，但其花色变化的影响途径有待深入探讨。【拟解决的关键问题】测定在不同含量Cu2+处理下滇水金凤盛花期花瓣色度值、细胞液pH值、色素和基础代谢物含量，分析Cu2+、各生理生化指标与花色之间的关系，为金属离子调控花色提供一定理论数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滇水金凤的种子采自云南省昆明市捞鱼河湿地公园（E102°46′02″，N24°49′34″），供试重金属为CuSO4·5H2O，处理液均用去离子水进行配置。试验采用水培法，于2020年9～12月进行。在西南林业大学树木园进行播种、育苗，挑选性状一致、生长健壮的滇水金凤植株，株高约30 cm，用去离子水将根部土壤冲洗干净后移入水培箱（4 L）水培一周，再用 1/2 改良Hoagland（不含CuSO4）驯化一周开始试验处理。基于课题组前期研究共设置5个铜（Cu2+）浓度梯度：0（CK）、5、10、15、20 mg·L-1，每个处理5个重复，每重复10株，每3 d更换一次营养液，以此保证铜浓度。在铜（Cu2+）处理30 d后，采集盛花期花瓣开展后续相关试验。

1.2 试验方法

参考陈小红[20]的方法测定花瓣明度L*、色相a*值和b*值、彩度C*和色相角h（°）；细胞液pH值测定参考Grlesbach[21]的方法；花色苷（Anthocyanin content）、总黄酮（Flavonoid content）和类胡萝卜素（Carotenoid content）含量测定参考陈小红[20]的方法；可溶性糖（Soluble sugar content）、可溶性蛋白（Soluble protein content）和脯氨酸（Proline content）含量测定参考李合生[22]的方法。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 26.0软件进行数据分析，采用Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣色度值变化

从图1可知，在不同含量Cu2+处理下，滇水金凤花瓣颜色发生变化，表现为花色随Cu2+含量增加逐渐变淡，花瓣色度值也发生了较大变化（表1）。明度L*在51.60～56.86，色相a*值范围介于17.60～29.27，色相b*值范围介于-8.06～-14.73。在Cu2+含量20 mg·L-1时，明度L*、色相a*值和b*值数值均最小，且与其他组比呈显著差异（P＜0.05）；彩度C*值逐渐变小，表明彩度变淡，与肉眼观察结果一致。色相角h变化不明显，仅在Cu2+含量为10 mg·L-1时急剧增大，其余都在-25°左右。

表1 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣色度值变化Table 1 Flower petal chromaticity of I. uliginosa treated with different concentration of Cu2+

图1 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣颜色变化Fig. 1 Variation of petal color of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.2 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣细胞液pH变化

从图2可知，滇水金凤花瓣细胞液pH值均为弱酸性，其花瓣细胞液pH值变化分为两个阶段：Cu2+含量为0～5 mg·L-1，pH值升高；Cu2+含量为10～20 mg·L-1，pH值逐渐下降，而花色开始变淡。Cu2+含量为5 mg·L-1和10 mg·L-1时，pH值差异不显著（P＞0.05），据2.1花色测定结果可知，这两个Cu2+含量下花瓣色相a*值变化不大，以上结果表明细胞液pH值大小可能影响花色苷稳定性。

图2 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣细胞液pH变化Fig. 2 Petal cell fluid pH of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.3 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣花色素含量的变化

色素是植物呈色的物质基础，随Cu2+含量增加，肉眼观测到花色逐渐变淡。从图3 -A可以看出，花色苷含量不断下降，与对照组比，均达显著性差异（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1时，花色苷含量最低，比CK少54.7%。总黄酮含量随Cu2+含量增加总体呈下降趋势，与对照比，均达显著性差异（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1时，总黄酮含量最低，比CK少40.91%（图3-B）。因此，花色苷和总黄酮含量减少是影响滇水金凤花色变淡的关键因素。随Cu2+含量增加，类胡萝卜素含量先下降再升高，在Cu2+含量20 mg·L-1时，类胡萝卜素含量最高，达0.13 mg·g-1，与其他组差异显著（P＜0.05），表明类胡萝卜素可能影响滇水金凤花色变化（图3-C）。

图3 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣花色素的变化Fig. 3 Anthocyanidins in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.4 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣基础代谢物含量的变化

糖作为花色苷合成的前体和信号物质，对花色形成有重要影响。可溶性糖含量随Cu2+含量增加而下降，与对照比，均存显著性差异（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1时，可溶性糖含量最低，比CK少48.5%，说明可溶性糖含量下降，在一定程度上抑制了花色苷的合成（图4-A）。随Cu2+含量增加，可溶性蛋白含量先降后升，Cu2+含量20 mg·L-1时，可溶性蛋白含量最高，为7.47 mg·g-1，是CK的2.10倍（图4-B）。脯氨酸是植物体内渗透调节物质，Cu2+含量在0～15 mg·L-1时，与对照比，脯氨酸含量无显著差异（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1时，脯氨酸含量低至98.42 μg·g-1，与其他组比呈显著性差异（P＜0.05）（图4-C）。综上所述，基础代谢物质含量变化与滇水金凤花色变化有着密切关系。

图4 不同含量Cu2+处理下滇水金凤花瓣基础代谢物含量的变化Fig. 4 Basal metabolites in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.5 Cu2+、各生理生化指标与花色之间的关系

2.5.1 简单相关分析 由表2可以看出Cu2+、各生理生化指标与花色之间存在着相关性。Cu2+与色相b*值呈极显著正相关，与色相a*值呈极显著负相关（P＜0.01），与明度L*呈显著负相关（P＜0.05）；明度L*与总黄酮、可溶性糖呈显著正相关，与可溶性蛋白呈显著负相关（P＜0.05）。色相a*值与花色苷、总黄酮、可溶性糖和脯氨酸极显著正相关，与可溶性蛋白极显著负相关（P＜0.01）；色相b*值与可溶性蛋白呈显著正相关（P＜0.05），与花色苷、可溶性糖、脯氨酸极显著负相关（P＜0.01）。Cu2+与可溶性蛋白呈显著正相关（P＜0.05），与花色苷、总黄酮、可溶性糖呈极显著负相关（P＜0.01）。可见，Cu2+通过影响滇水金凤色素、基础代谢物含量来调控花瓣呈色。

2.5.2 逐步回归分析 在相关性分析中Cu2+、各生理生化指标与花色之间表现出显著差异性影响因素较多，进一步从各生理生化指标进行逐步回归分析，分别找到受Cu2+影响最显著的因子及影响色相a*值、色相b*值最显著的因子（P＜0.05）。逐步回归方程（表3）表明，Cu2+与可溶性蛋白含量呈显著正相关，与色相a*值呈显著负相关（P＜0.05），表明Cu2+对色相a*值和可溶性蛋白含量有直接影响。色相a*值与花色苷、脯氨酸呈正相关（P＜0.05）；色相b*值与可溶性糖呈显著正相关，与色相a*值呈显著负相关（P＜0.05），表明显著影响滇水金凤花瓣呈色因素有花色苷、脯氨酸和可溶性糖含量。

表3 Cu2+、各生理生化指标与花色之间的逐步回归分析Table 3 Stepwise regression on Cu2+, physiological and biochemical indices, and flower color

3 讨论与结论

为更直观、准确地研究Cu2+、各生理生化指标与花色之间的相关性，对花色Lab进行测定，可使花色描述由模糊变为量化[23]。本研究发现随Cu2+含量增加滇水金凤花瓣颜色变淡，相关性分析表明Cu2+与色相b*值呈极显著正相关，与色相a*值呈极显著负相关（P＜0.01），且逐步回归分析中发现Cu2+与色相a*值呈显著负相关（P＜0.05），表明Cu2+是影响色相值的重要因素。

花瓣颜色受细胞液pH值调控，如日本牵牛（Pharbitis nil）在花蕾期紫红色细胞液pH为6.6，在开花期蓝色细胞液pH为7.7[24]。本研究发现滇水金凤紫红色细胞液pH值均为弱酸性，随Cu2+含量增加，pH值先增后减，与花色苷含量相关性不显著，表明细胞液pH值变化对花色调节作用不明显，与金银花（Lonicera japonica）[25]研究结果较为一致。

虽然影响花瓣呈色原因众多，但最主要原因是色素种类在植物细胞中的存在，影响植物花色色素主要有3类：类黄酮化合物、类胡萝卜素和甜菜色素[16,26]。花色苷属于类黄酮化合物，是影响植物色彩呈现关键因素[27]，如在腊梅（Chimonanthus praecox）[28]、玉兰（Magnolia）[29]、丽格海棠[12]等研究中发现花色苷含量变化是影响植物花瓣呈色的主要因素。本研究发现随Cu2+含量增加滇水金凤花瓣颜色变淡，总黄酮、花色苷、脯氨酸、可溶性糖含量呈下降趋势，相关性分析表明影响色相a*值、b*值因素有花色苷、总黄酮、可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量，且逐步回归分析中色相a*值与花色苷、脯氨酸含量呈显著正相关（P＜0.05），色相b*值与可溶性糖呈显著正相关（P＜0.05），表明花色苷、脯氨酸含量是直接影响色相a*值的重要因素，可溶性糖含量是影响色相b*值的重要因素。因此，花色苷和基础代谢物含量是影响花瓣呈色的关键因素。

花色苷是由色素和各种糖自然形成，故其生物合成与糖含量高低有密切关系[9]。本研究发现随Cu2+含量增加可溶性糖含量下降，其与花色苷含量极显著正相关（P＜0.01），表明可溶性糖含量的减少抑制了花色苷积累，与江洁蓓[13]、张超[29]研究结果一致。脯氨酸是植物体内渗透调节物质，逆境胁迫下能调节植物生长发育[30]，本研究发现随Cu2+含量增加脯氨酸含量下降，其与花色苷含量呈显著正相关（P＜0.05），表明脯氨酸含量影响花色苷合成，与珙桐[31]苞片研究一致。不同植物的可溶性蛋白和花色苷含量表现出很大差异性，如红栌（Cotinus coggygria‘Royal Purple’）中两者显著正相关（P＜0.05）[32]，矮牵牛（Petunia hybrida）研究表明可溶性蛋白和花色苷含量之间没有直接关系[33]。本研究发现随Cu2+含量增加可溶性蛋白含量明显上升，其与花色苷含量呈极显著负相关（P＜0.01），表明可溶性蛋白抑制了滇水金凤花色苷合成，与粉红珙桐[13]研究结果一致。因此，基础代谢物含量影响花色苷合成。

不同浓度不同金属离子对植物的影响是不一样的[34]，如李荣华[18]发现红色新几内亚花色受Cu2+和Al3+浓度影 响，当Cu2+浓度为3.2×10-7mol·L-1时，其花色均最深；随Al3+浓度增加，其花色先变浅后又逐渐加深；Schreiber等[35]发现绣球花发蓝所需Al3+阈值为40 μg·g-1，10 μg·g-1Al3+足以让萼片颜色从红向紫变化。本研究肉眼观测到随Cu2+浓度增加滇水金凤花色逐渐变浅，当Cu2+含量为20 mg·L-1时，花色最浅。相关性分析表明Cu2+与可溶性蛋白呈显著正相关（P＜0.05），与花色苷、总黄酮、可溶性糖呈极显著负相关（P＜0.01），逐步回归分析发现Cu2+与可溶性蛋白含量呈显著负相关（P＜0.05），表明Cu2+含量影响基础代谢物含量。

综上所述，花色苷含量是影响滇水金凤花色变化的主要因素，Cu2+浓度影响控制合成花色苷的基础代谢物含量，推测Cu2+是通过调控滇水金凤花色苷的生物合成来影响花瓣呈色。本研究仅分析Cu2+、各生理生化指标与花色之间的关系，今后研究还应从解剖结构、分子遗传等方面对滇水金凤花色变化机制进行深入研究。