王凯凯 王晓璐 苏小运 张杰

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

CRISPR-Cas9是十分便捷、有效的基因组编辑工具［1］，近年来已经成功应用于植物、动物、微生物等多种生物中。Xing等［2］在pGreen和pCAMBIA载体上设计组装多个gRNA序列，引导Cas9蛋白同时特异性识别和切割多个基因序列，在玉米和拟南芥等植物中实现了基因高效编辑。Li等［3］以Tet家族基因作为靶标，经显微注射将靶向Tet的sgRNA与Cas9 mRNA一起引入大鼠胚胎细胞中完成了多基因高效编辑。甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母是生产异源蛋白质最常用的表达系统之一，经密码子优化的Cas9基因序列与不同启动子组成表达盒，可实现接近100%编辑效率［4］。在大肠杆菌中，Zhao等［5］通过Golden Gate方法将Cas9系统与促进同源重组的蛋白基因recA组装，成功构建了pRed_cas9_recA_Δpoxb300质粒，利用此单质粒对lacZ基因敲除验证了敲除效率，并且利用其携带的温敏性复制起始位点通过提高培养温度剔除质粒可进行连续基因敲除。

理论上CRISPR-Cas9系统可以靶向任何基因进行编辑，但实验发现微生物中关键基因的敲除依然十分困难。CRISPR-Cas9系统针对不同的基因或宿主时，基因编辑往往会受到十分复杂的影响，除了gRNA选择的影响外，基因组编辑效率还受到非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组（homology directed repair，HDR）DNA修复机制的影响［6］。前期关于CRISPR-Cas9系统已有大量报道提供了优化策略，以提高基因编辑效率和避免脱靶效应［7-8］，但依然未能解决关键基因敲除效率下降的问题。在微生物的代谢改造中，根据设计需求往往需要对影响宿主生长及代谢的关键靶点基因进行单个或连续的基因编辑，以改变宿主的生长状态或代谢流流向，达成代谢改造目的［9-10］。……