程兆瑞，程小平，李福堂，阳建超，孙诚谊，喻 超

(1.贵州医科大学附属医院肝胆外科，贵阳 550004；2.南昌大学第一附属医院病理科，南昌 330006)

肝癌是世界第五大常见癌症，是导致癌症相关死亡的第三大原因[1]。有研究[2]显示，晚期肝癌患者总体5年生存率<5%。miRNAs是一类长度在21～23个核苷酸长度的非编码RNA[3]。通过与靶基因结合减少靶基因的表达，miRNAs可调控细胞的增殖、转移和分化等多种生物学行为[4]。目前，已有多种miRNAs被发现与肝癌的发生、发展有着密切联系：KE等[5]研究发现，miR-148b在肝癌中呈低表达且通过介导肿瘤相关巨噬细胞的浸润，促进肝癌的生长和转移；WANG等[6]研究显示，miR-383可通过靶向IL-17激活STAT3信号通路，从而抑制肝癌细胞的增殖并促进肝癌细胞的凋亡；XU等[7]研究发现，miR-885-5p在肝癌细胞中表达显著减少，直接靶向HK2调节肝癌代谢重编程从而抑制肝癌的增殖和转移。本研究探讨miR-4530对肝癌细胞增殖的影响及其机制，为肝癌的治疗提供可能的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

高糖DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco生物公司；miR-4530模拟物及阴性对照模拟物购自武汉聚能慧达生物有限公司；TRIB1(tribbles pseudokinase 1)过表达质粒购自山东维真生物科技有限公司；RT试剂盒、聚合酶链式反应(PCR)相关SYBRP、逆转录试剂盒均购自日本Takara生物技术有限公司；双荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司；脂质体2000、制胶试剂盒、脱脂奶粉和山羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；单克隆兔源性TRIB1抗体和鼠源性GAPDH购自美国CST公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪和凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 qRT-PCR检测

收集人肝癌细胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7细胞及正常肝细胞LO2，加入1 mL Trizol，裂解10 min。先后加入氯仿、异丙醇，12 000 r·min-1离心15 min，弃上清。沉淀经70%乙醇洗涤后，加入30 mL无酶水，测量RNA浓度，根据逆转录试剂盒进行逆转录；加入SYBR Green荧光染料，检测miR-4530和TRIB1的表达。其中，miR-4530以U6为内参，TRIB1以GAPDH为内参，应用2-ΔΔct法计算其在细胞中的相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 细胞培养及分组

人肝癌细胞MMC-7721、HepG2、Hep3B和Huh-7细胞及正常肝细胞LO2均培养在含10% FBS和1%青链霉素的高糖DMEM培养基中，将培养皿置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。隔天换液，汇合度达80%时传代并进行后续实验。miR-4530阴性模拟物(NC mimic组)、miR-4530模拟物(miR-4530 mimic组)、TRIB1过表达质粒(TRIB1-U组)以及miR-4530过表达模拟物联合TRIB1过表达质粒(miR-4530 mimic+TRIB1-U组)均以脂质体2000转染24 h，qRT-PCR检验转染效率。……