张冰洁，水雯箐†

①上海科技大学 iHuman研究所，上海 201210；② 上海科技大学 生命科学与技术学院，上海 201210

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）是人体中最大的一类膜蛋白受体家族，参与调控多种重要的生理和病理过程，因而也是一类极为重要的药物靶标。据统计，超过30%的上市药物通过靶向特定的GPCR发挥治疗作用[1]。因此，各大制药企业和科研单位都在不遗余力地筛选、设计靶向特定GPCR的新型配体，以期获得高效价、高选择性的药物先导化合物。

目前，以GPCR为靶标蛋白进行配体筛选的方法多种多样，各种技术依据其特点应用于药物先导化合物早期发现流程中的各个阶段。根据技术原理和检测方式的差异，通过湿实验进行GPCR配体筛选的方法主要分为以下三类：基于受体-配体亲和作用（affinity/binding-based）的筛选方法、基于蛋白热稳定性（stability-based）的筛选方法以及基于细胞信号通路活性检测（cell signaling-based）的筛选方法。基于受体-配体亲和作用的筛选方法可检测GPCR靶蛋白与化合物的直接相互作用，并定量亲和力的高低。其中DNA编码化合物库（DNA encoded library,DEL）筛选技术因其庞大的筛选规模（数十亿化合物）和高效的检测手段（高通量测序）成为当前新药发现领域最前沿的技术之一[2-5]，而且已经成功应用于GPCR的配体筛选和发现[6-8]。然而需要指出的是，DEL技术通常需要对化合物进行DNA偶联反应，该步骤可能影响或破坏化合物与受体的天然相互作用。亲和质谱技术是另一种迅速发展、得到广泛关注的GPCR配体筛选方法[9-14]，同样基于对受体-配体结合的检测。研究表明，该技术能够在进行高通量筛选的同时半定量地评估多个配体对于同一靶标的相对亲和力[12,15]。

基于细胞信号通路活性检测的筛选方法，主要通过检测由GPCR蛋白介导的特定信号通路中的下游效应分子（如cAMP、Ca2+、IP1/IP3等）反映出配体对受体功能的调控作用。基于蛋白热稳定的筛选方法，通常需要获得体外纯化的靶蛋白，加入待测配体，描绘蛋白的熔解温度曲线，进而评价配体对靶蛋白热稳定性的影响。表1总结了这三大类实验筛选方法中各种常用技术可测量的相互作用参数和分析通量。基于亲和作用的筛选技术与基于细胞信号通路活性检测的筛选技术具有高度互补性，因此在早期先导化合物的发现过程中，将多种技术联合用于靶向GPCR的配体筛选能极大程度地降低假阳性和假阴性率，提高药物先导化合物的发现几率[15]。本文主要介绍亲和质谱技术用于GPCR配体筛选的基本原理及其特点，并详细总结该技术用于大规模化合物库及天然草本粗提物筛选的前沿进展。

表1 应用于GPCR靶向的配体筛选的各种实验技术

1 亲和质谱筛选技术

现代生物质谱由于其高灵敏度、高特异性和快速的分析速度，已经发展成为探究蛋白质与各种配体（小分子化合物、小肽、核酸或金属离子）以及蛋白质-蛋白质相互作用的关键技术（表1）。基于质谱的亲和作用筛选技术在以可溶性蛋白为靶标的配体筛选中得到了广泛应用[9-14]，而近期也成功拓展到更具挑战的以GPCR为靶标的配体发现中。基于质谱的亲和作用分析方法主要分为两大类：一类是检测溶液中结合于靶蛋白上配体的亲和质谱技术（affinity MS），具体包括自动化配体筛选系统、超滤亲和质谱技术、前沿亲和色谱-质谱技术、基于细胞膜的亲和质谱筛选技术和竞争性结合质谱检测[16-21]；另一类是在气相中检测蛋白-配体复合物的非变性质谱技术（native MS）[22-23]。

与其他药物早期发现流程中的配体检测主流技术相比，亲和质谱筛选技术具有以下独特的优势：①无偏向性，可同时筛选正构和别构作用配体；②可分析高度复杂的配体混合物，确认配体的化学结构；③一般无需标记配体和靶蛋白，维持蛋白-配体复合物的天然构象；④定量准确，能够评估配体的亲和力大小；⑤靶蛋白消耗量低；⑥方法普适性高，适用于不同类型的靶蛋白。以下逐一介绍特定的亲和质谱技术在GPCR配体筛选和药物发现中的应用实例。

1.1 自动化配体筛选系统

自动化配体筛选系统（automated ligand identification system, ALIS）是目前制药企业开展大规模合成化合物库高通量配体筛选时最为广泛采用的技术之一[9,12,24-27]。该系统通过分子排阻色谱将靶蛋白-配体复合物与游离配体进行分离，然后靶蛋白-配体复合物在反相色谱中解离，从靶蛋白上释放的配体进入高分辨质谱中进行定性和定量分析。ALIS在可溶性蛋白的配体筛选中得到了广泛应用，但是由于GPCR这类膜蛋白难以获得大量稳定的纯化蛋白，因此该项技术用于GPCR配体筛选的报道较为少见。最早将ALIS用于GPCR配体筛选工作的是Whitehurst等人[21]将其用于毒蕈碱类乙酰胆碱受体（muscarinic M2 acetylcholine receptor, mAChR）的配体发现。他们将纯化的猪源M2蛋白与1 500个化合物组成的混合物为一个单元进行亲和筛选，在对35万个成员组成的化合物库完成筛选后，发现了2个mAChR的配体，包括1个拮抗剂和1个别构调节剂。随后，另一个研究团队采用类似的筛选策略开展了对人源趋化因子受体CXCR4的配体筛选研究[21]。值得一提的是，Whitehurst等人将250 ng纯化的蛋白与100或2 000个化合物进行孵育，按照该反应条件，完成了对4.8万和275万个化合物组成的超大化合物库的筛选工作。最终，他们从中共发现了362个潜在配体，进一步的研究表明其中34个化合物是CXCR4的新型拮抗剂[21]。

1.2 基于细胞膜和纯化蛋白的亲和质谱筛选

虽然ALIS已经成功应用于GPCR的配体筛选中，但是将该技术拓展于其他的GPCR靶标蛋白仍然存在巨大挑战。这主要是因为GPCR是一类七次跨膜螺旋的膜蛋白，其天然活性形式稳定性差，表达量低，通常需要花费大量的时间、精力来优化GPCR蛋白的重组表达和纯化条件[21]。为了突破这一局限，我们课题组建立了基于细胞膜的亲和质谱筛选技术，用于靶向GPCR蛋白的配体筛选[19]。该方法以高表达特定野生型GPCR的细胞膜组分为筛选对象，与小分子混合物进行孵育，收集细胞膜上富集的配体，然后通过高分辨质谱进行定性和定量分析（图1（a）），同时根据化合物结合指数BI区分强结合、弱结合与非特异性结合（图1（b））。我们以480个化合物组成的混合物为一组进行筛选，每组需要约 2 μg处于细胞膜上的GPCR蛋白。通过对一个4 333个小分子组成的化合物库进行筛选，我们成功发现了1个靶向五羟色胺2C受体（5-HT2CR）的新型拮抗剂与4个靶向胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的新型正向别构调节剂（图1（c））。该新技术的最大特点是省去了膜蛋白的纯化步骤，使得GPCR蛋白处于天然细胞膜环境中，最大程度维持其天然活性构象。

为了进一步提高筛选效率，我们发展了一项新型的多轮富集亲和质谱筛选技术，该方法能够一次性从2万个小分子组成的混合物中快速筛选出靶向GPCR的高亲和力配体，极大减少了筛选所需的实验成本和仪器机时。我们以A2A腺苷受体（A2AR）为靶标蛋白，分别对 480个、2 400个、4 800个和2万个成员组成一个混合物进行配体筛选，结果显示A2A受体的16个阳性小分子中具有较高亲和力的配体（Kd或Ki＜ 5 μmol/L），无论常规通量（480个）或是提高通量（2 400个、4 800个、2万个）都能被筛选出。同时，该方法不仅适用于纯化的GPCR蛋白，也适用于表达GPCR蛋白的细胞膜组分的配体筛选。利用该方法，我们成功发现了3个靶向A2AR蛋白的新型拮抗剂。目前单次实验的筛选通量是每组2万个化合物，如果进一步提高对化合物库富集的效率，我们预期该技术可以达到一次性筛选十万个甚至百万个混合物的筛选通量，逐渐接近DEL的筛选水平[28]。

图1 基于细胞膜的亲和质谱技术筛选靶向GPCR的新型小分子调节剂。（a）亲和质谱筛选流程。（b）基于细胞膜的亲和质谱筛选靶向GLP-1R小分子配体结果。化合物库由4 333个成员组成，分为9个混合物分别进行筛选。红色圆点表示筛选发现的潜在配体，灰色圆点表示未结合的化合物。（c）亲和质谱筛选发现的5-HT2CR（上）与GLP-1R（下）新型小分子调节剂在放射性同位素标记实验中得到进一步验证

近年来，亲和质谱技术因其能够快速从天然产物粗提物中富集并鉴定到针对特定蛋白靶标的小分子配体，从而在以代谢酶为代表的可溶性蛋白的配体筛选中得到了广泛应用，明显提高了天然草药中有效活性组分的发现几率[29-34]。我们课题组首次拓展亲和质谱筛选技术用于从天然产物粗提取中筛选靶向GPCR的新结构、新活性配体。我们首先对多种中药提取物进行了5-HT2C受体的细胞活性评价，然后针对活性较好的中药提取物开展亲和质谱筛选。同时，我们将亲和质谱与代谢组学技术相结合，使得复杂的中药提取物中各组分化合物的结构鉴定更为灵敏和准确（图2（a））。通过该方法，我们快速从中药提取物中发现了靶向5-HT2C受体的新型选择性激动剂巴婆碱（asimilobine）。随后的药理学研究显示，该化合物能够特异性激活5-HT2C受体，而对同源性很高的五羟色胺2A受体（5-HT2AR）和2B（5-HT2BR）没有激动活性（图2（b～d））。同时，它能偏向性地激活Gq蛋白下游信号通路而不影响β-arrestin招募通路，并且在急性和慢性实验动物模型上发现巴婆碱通过抑制小鼠进食来降低体重。该研究提供了一种高效的研究手段，有助于从复杂的天然产物中发现靶向GPCR的新结构、新活性配体[35]。

尽管未直接应用于GPCR蛋白，但是基于全细胞的针对血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）配体筛选的报道值得我们关注，并且该方法有望应用于GPCR的配体发现[36]。作者针对过表达VEGFR2的细胞构建了一种特殊的“一珠一化合物”的多肽样品库，荧光显微镜下选择与被标记的VEGFR2细胞结合的珠子，并用串联质谱分析对所附配体进行解码。该研究中发现的活性最好的配体对可溶性VEGFR2胞外结构域具有低微摩尔级的亲和力。

图2 （a）亲和质谱筛选流程；（b）结合代谢组学技术从分段后的中药提取物中筛选到的潜在配体（加大的粉色圆点表示阿朴菲类生物碱；BI表示化合物结合指数）；（c）通过MS/MS谱图进一步确认化合物1857的结构；（d）1857选择性激动5-HT2C受体

1.3 竞争性结合质谱检测

竞争性结合质谱检测最初由Wanner研究组开发，使用非放射性同位素标记的示踪配体与待测试化合物进行竞争，这与放射性同位素标记的配体结合实验的原理相似，但是该方法避免使用放射性同位素试剂，提高了实验的可操作性和安全性[37-39]。该实验中，将示踪配体从靶蛋白上解离释放，采用质谱多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）技术对其进行定性和定量分析，提高了化合物检测的灵敏度和特异性。值得一提的是，该方法的研究对象是过表达目标蛋白的细胞膜组分，可用于膜受体与配体结合作用的生化表征。

目前，竞争性结合质谱分析不仅成功应用于转运蛋白（transporter）和离子通道（ion channel）的配体表征中，而且在GPCR蛋白上也同样得到应用。例如，最近腺苷受体A1/A2A和多巴胺受体D1/D2/D5与其配体相互作用均通过该方法进行表征[18,38,40-41]。研究者证明了该方法能够用于饱和、置换、解离与竞争相关的各项配体表征实验中，而且通过放射性同位素标记结合实验与竞争性结合质谱实验得到的用于表征受体-配体结合作用的主要参数非常吻合[18,40]。目前，该方法主要用于表征特定化合物的结合属性，或者在相对较低的通量下对专属性化合物库进行配体筛选。

2 展望

基于受体-配体亲和作用的筛选技术与传统的基于细胞信号通路活性检测的高通量筛选技术高度互补，已发展成为药物早期发现流程中的关键性技术。亲和质谱筛选技术为靶向GPCR蛋白的配体发现研究提供了一种高通量、无偏向性、灵活便捷的筛选手段，尤其适用于功能不明确、缺乏细胞活性检测手段的靶标，例如对孤儿受体进行内源性配体的鉴定或工具性化合物的开发。同时，将亲和质谱筛选与代谢组学技术相结合，有望从复杂的天然产物库或组织、细胞代谢物组中高效发现靶向GPCR蛋白的新结构、新活性配体。我们相信，将亲和质谱筛选技术与组学技术、生物信息学技术和GPCR分子药理学手段结合，将加速靶向GPCR的高选择性、高效价的工具化合物开发与新药发现。