陈 洁 吕耀平 戴庆敏 张 乐 徐传保 陆 君

(1.丽水学院生态学院,丽水 323000;2.丽水学院医学与健康学院,丽水 323000;3.丽水市农业农村局,丽水 323000)

多数淡水鱼类,尤其是鲤科鱼类都具有一定数量的肌间刺[1—3]。肌间刺的存在影响了鱼肉的食用和深加工。为了去除肌间刺,人们早在20世纪60年代就开展了肌间刺的研究工作[4]。肌间刺是位于椎骨两侧肌肉中的膜性硬骨,由肌隔结缔组织不经软骨阶段直接骨化而成[5,6]。肌间刺的形成开始于间叶细胞,由间叶细胞转变为成骨细胞[7]。然而,到目前为止,对于肌间刺的研究工作主要集中于形态学方面[3,8],对其形成的分子机制研究的较少。

骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)属于转化生长因子β(Transforming growth factorbeta,TGF-β)超家族。目前,已经鉴定了30多个骨形成蛋白[9]。骨形成蛋白是一类具有广泛生物活性的生长因子,除具有诱导骨形成功能外,还参与了造血组织发育、胚胎发育、神经发育和脂肪生成与代谢等诸多过程[10—12]。在骨形成蛋白家族中,BMP2属于分泌性多功能蛋白,具有较强的诱导骨细胞形成的能力。例如,BMP2在间叶细胞分化为成骨细胞过程中起到重要的调控作用[13]。目前,bmp2基因已在斑马鱼(Danio rerio)[14,15]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)[16]、建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian)[17]和金头鲷(Sparus aurata)[18]等鱼类中被克隆报道。在团头鲂中,bmp2基因表达与肌间刺骨化存在一定的关系[16]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 唇䱻bmp2a基因cDNA克隆及序列分析

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 茜素红染色

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

1.5 免疫组化

1.6 数据分析

所有数据均以平均值±标准误表示。使用IBM公司SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,P＜0.05表示显著性差异。

2 结果

2.1 唇䱻bmp2a基因序列分析

氨基酸多重序列比对显示鱼类BMP2保守性较高且都具有信号肽、TGFβ前肽结构域(TGFβ propeptide domain)和TGFβ结构域(TGFβ domain)。在TGFβ结构域中存在一个N-糖基化位点。此外,包括唇BMP2A蛋白在内,鱼类BMP2蛋白都具有7个保守的半胱氨酸残基。

图1 基于BMP2蛋白氨基酸序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequences of the BMP2 protein

2.2 唇䱻尾部肌间刺四个主要发育阶段的形态特征

图2 唇肌间刺骨化的四个关键时期Fig.2 Development characteristics of intermuscular bones in the four key development stages of barbel steed

2.3 唇䱻bmp2a基因组织差异表达

利用RT-qPCR检测bmp2a基因在唇成鱼不同组织中的表达情况,结果显示,bmp2a在被检测的组织中均有表达,在鳃中的表达量最高,肝中次之,在心脏中表达量最低。在鳃中的表达量是在心脏中的28.1倍(图3)。

2.4 唇䱻BMP2A蛋白在不同组织中的分布

2.5 肌间刺骨化过程中bmp2a基因的表达

利用免疫组化发现BMP2A蛋白在肌肉肌隔处有表达,为进一步确定bmp2a基因与肌间刺骨化的相关性,在肌间刺骨化的四个关键阶段,检测了尾部肌肉组织中bmp2a基因的表达情况。结果显示,唇bmp2a基因随着肌间刺的骨化其表达量逐渐升高,与阶段Ⅰ比较,bmp2a基因在阶段Ⅱ和Ⅲ的表达量显著升高,此时肌间刺正在快速骨化。到了阶段Ⅳ,bmp2a基因表达量有所降低,但与阶段Ⅰ比较仍显著升高,此时肌间刺已进入最终骨化阶段(图5)。

3 讨论

BMP2属于骨形成蛋白家族,是分泌型多功能蛋白,具有较强的诱导骨细胞形成的能力。目前,bmp2基因已在斑马鱼[14]、团头鲂[16]、建鲤[17]和金头鲷[18]等鱼类中被克隆报道。在团头鲂中,bmp2基因表达与肌间刺骨化存在一定的关系[16]。为进一步明确bmp2基因与肌间刺骨化的相关性。本研究克隆得到了唇bmp2a基因cDNA序列。经多重序列比对发现鱼类BMP2蛋白都具有一个高度保守的TGFβ结构域,在该结构域中存在一个N-糖基化位点,这一特征表明BMP2蛋白在脊椎动物中具有非常保守的功能,特别是与骨发生和骨形成等细胞分化相关[18]。此外,包括唇BMP2A蛋白在内,鱼类BMP2蛋白都具有7个保守的半胱氨酸残基[17,18]。

图3 唇bmp2a基因组织差异表达分析Fig.3 The relative expression of bmp2a in different tissues of the barbel steed

图4 唇BMP2A蛋白在不同组织中的分布Fig.4 Distribution of BMP2A protein in different tissues

图5 唇bmp2a基因在肌间刺骨化不同阶段的表达Fig.5 Relative expression patterns of bmp2a during intermuscular bone development

BMP2 被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子[28],在骨骼形成的起始和调节中具有主要作用[29]。免疫组化实验证实唇BMP2A蛋白分布于肌肉肌隔中。为了进一步明确唇bmp2a基因与肌间刺骨化的相关性,利用RT-qPCR检测了唇bmp2a基因在肌间刺骨化的4个关键时期的表达。结果显示,唇bmp2a基因随着肌间刺的骨化其表达量逐渐增加,与阶段Ⅰ相比,阶段Ⅱ到Ⅳ的表达量均显著增加。阶段Ⅱ到Ⅲ,肌间刺处于快速骨化阶段,bmp2a基因表达量持续增加,到了阶段Ⅳ,bmp2a基因表达量有所降低,此时肌间刺骨化接近于完成。bmp2a基因表达与肌间刺的骨化时序相吻合。此外,发现与阶段Ⅰ相比,阶段Ⅲ时bmp2a基因表达最高,表达增长3倍多,而在团头鲂中也发现类似的变化,团头鲂bmp家族基因从阶段Ⅰ到阶段Ⅳ变化倍数都在2倍左右[16]。虽然变化倍数不是特别明显,但是BMP蛋白属于转化生长因子β超家族,可通过其受体触发级联反应[30],从而对肌间刺骨化起到一个较强的调控作用。