李 颖 王 丁* 肖武汉*

(1.中国科学院水生生物研究所,武汉 430072;2.中国科学院大学,北京 100049;3.中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室,武汉 430072)

鲸类作为哺乳动物中极其特殊的一个分支,其生理结构、分子调控机制和进化机制具有重要的研究价值,如鲸类特殊的回声定位系统,特殊的皮肤和渗透压调节机制以及潜水适应机制[1]。此外鲸类作为水生态系统的顶端捕食者,对维持食物链的完整性和连续性具有重要意义。

长江江豚(Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis)隶属齿鲸亚目鼠海豚科江豚属,是鼠海豚科唯一的淡水种群,分布于我国长江中下游干流宜昌至上海区段、鄱阳湖、洞庭湖及部分支流[2,3]。从1996年国际自然保护联盟物种生存委员会(IUCN)红皮书将长江江豚列为濒危(EN)物种,到2013年IUCN濒危物种红色名录中的极度濒危（CR）。随着人类扰动的持续增强,长江江豚的数量仍在持续下降[4—6],非自然死亡现象频发,若长江环境得不到改善,种群必将出现更为剧烈的下降,甚至是种群灭绝[7]。对于这种长江珍惜濒危鲸类,亟待我们采取多种拯救和保护措施,以避免其陷入不可挽回的局面。

鲸豚类营水生生活,活动范围广,动物实验无法开展;同时因伦理、法律等原因,损伤鲸豚类个体的实验难以开展,这些在一定层面上限制了对鲸豚类生命机制的探索。20世纪70年代,细胞体外培养技术开始蓬勃发展,很多鲸类学者借助细胞培养体外平台开展鲸类体外培养的相关的研究,包括大翅鲸(Megaptera novaeangliae)、侏儒抹香鲸(Kogia breviceps)、侏虎鲸(Feresa attenuata)、露脊鲸(Eubalaena japonica)和白鲸(Delphinapterus leucas)等[8—12]。体外培养细胞保持了动物个体的细胞和遗传特性,从某些方面克服了鲸豚类动物活体实验的限制。在成功分离具有活性的细胞后,借助显微观测技术以及分子检测手段可以开展鲸豚类细胞生物学、分子遗传学和毒理学等相关研究[13—15]。由于鲸类原代细胞具有难以培养特性,在体外传代次数有限[16],难以满足某些实验要求。SV40T(Simian virus 40 T-antigen)被认为是建立永生化细胞最简单可靠的基因[17]而被广泛使用。鲸类学者将其应用到鲸类细胞永生化的实验中。主要是将携带SV40T抗原的质粒转入鲸豚类细胞,以期获得稳定的细胞株[18]。

目前长江江豚的研究集中在噪声、生态学、生理和行为方面[19—22],有关长江江豚细胞层面的研究极少。除了2010和2011年,王京真等[23,24]报道多长江江豚细胞的培养条件和染色体核型外,后续长江江豚的细胞系的研究未见报道。随着长江江豚全基因测序的完成,长江江豚的研究已经进入了分子生化时代。建立稳定的长江江豚细胞系,便于我们利用影像技术进行形态结构分析,使用分子、生化和免疫技术进行物质变化检测。建立稳定的长江江豚细胞系也为细胞生理学、细胞免疫学和细胞遗传学等提供稳定均一的研究样品,便于后续开展江豚的免疫应答机制和此外,构建稳定长江江豚细胞系,可以更好的将先进分子技术手段运用于长江江豚的疾病治疗、饲养繁殖等工作中[25]。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料实验所用脐带来于一母豚产子后产下的胎盘。从幼豚产出到胎盘产出约8h,胎盘重约0.72 kg,胎盘上脐带约为17 cm。

主要试剂和仪器DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Gibco)、胎牛血清(Fetal bovine serum;Hyclone)、青霉素-链霉素(Penicillins-Streptomycin;BI)、两性霉素B(Amphotericin B,BI)、PrimocinTM(InvivoGen)、胰酶(Tripsin-EDTA;Hyclone)、PBS(phosphate-buffered solution,without Ca2+and Mg2+)、CCK-8试剂盒(cell counting kit 8;上海翊圣)、Lipofectamine 3000 Reagent(Invitrogen)和SV40 T antigens(pW2载体;中国科学院水生生物研究所鱼类低氧生物学实验室,武汉）

倒置荧光显微镜(徕卡DMi8-电动;Leica)、Spectra Max i3x多功能酶标仪(Spectra Max i3x:Molecular Devices)、CO2恒温培养箱(Forma Class II Water Jacked CO2Incubator;Thermo)、超净工作台(Forma Class II A2 Biological Safety Cabinet;Thermo)和离心机(Centrifuge 5702;Eppendorf)。

1.2 方法

脐带组织的收集胎盘在长江江豚生产8h后产出,胎盘产出后,使用无菌工具取3份3 cm的脐带,用终浓度为100 U/mL的双抗和5.0 μg/mL两性霉素B的PBS溶液洗涤3次后,浸泡于添加抗生素的PBS中。

长江江豚脐带细胞的原代培养(1)组织块培养:将脐带剪开,使用无菌镊子剔除脐带表面的静脉膜和血块,使用含100 U/mL青霉素-链霉素的PBS溶液多次冲洗,将组织剪成1 mm3左右的方块,使用15 mL移液管将组织块均匀分布在10 cm2培养瓶中,滴3滴纯胎牛血清,倒置3—4h,再将培养瓶正置并缓缓加入3 mL的完全培养基,完全培养基包含15%FBS、85% DMEM、100 U/mL青霉素-链霉素、1×PrimocinTM和5 μg/mL的两性霉素B。保证组织块未漂浮,放入37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱,24h后,加入3 mL培养液(盖过小的组织块为准),每隔3d更换一次培养基。(2)胰酶消化法:脐带切碎后于0.25%胰蛋白酶,37℃搅拌1h,使用70目的过滤网,收集滤后含细胞的悬液,离心,加入含血清的培养基,重悬于培养皿。

细胞传代当培养的原代细胞汇合到80%—90%时,弃培养基,PBS洗涤,添加2 mL的0.25%的胰酶,于培养箱内消化约10min,待大部分细胞变圆漂浮脱壁,加入4 mL含15%的FBS的DMEM培养基终止消化。用移液器吹打细胞至游离的悬浮细胞,按照1﹕3比例传入培养皿,继续培养,等细胞汇合到80%—90%时,进行下一轮传代。

细胞纯化脐带组织分离出的细胞主要为成纤维细胞和内皮细胞,成纤维细胞和内皮细胞对于胰酶的敏感度存在差异,成纤维细胞易消化漂浮,内皮细胞对胰酶敏感度较差后被消化,成纤维细胞贴壁较快,生长速度较快,3—5次传代后,即为成纤维细胞。

细胞永生化和鉴定在第5代原代细胞达到70%—80%汇合时,进行转染实验。在2个1.5 mL管中分别加入200 μL未添加抗生素以及血清的DMEM培养基,按照DNA﹕转染试剂为1﹕2的比例进行添加,一管加入pW2-Tt-SV40 T antigens 即包装SV40 LT antigens(Large T-antigen)和ST(Small T-antigen)的表达质粒20 μg,一管加入转染试剂Lipofectamine 3000 Reagent 40 μL,5min之后,将两者混匀,20min之后,将混合液添加到10 cm2培养皿。12h后,更换1/3的培养液,24h后,更换1/3的培养液。36h后,根据细胞状态进行传代。并根据已建立的方式[26],进行永生化细胞系中SV40T表达,以原代细胞作为对照,取永生化后15代细胞,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR检测SV40 LT和SV40 ST的表达。使用引物见表1。扩增程序设定为:98℃ 5min预变性;98℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 15s,35个循环;72℃延伸5min。

表1 检测SV40 T antigens的小T抗原和大T抗原区域的引物列表Tab.1 PCR primers used to amplify the ST and LT region of SV40 T antigens

永生化后的细胞冻存与复苏(1)取第12代、第15代 和第17代汇合度为85%—95%的细胞,吸除培养液,PBS清洗1次,加入2 mL 0.25%胰酶,待细胞悬浮为单个游离细胞,加入2 mL含有血清的培养基,吹匀并移至15 mL离心管,1000 r/min离心5min,弃上清,加入细胞冻存液后重悬细胞,稀释细胞浓度至5×106个/mL,分装1 mL至冻存管中,冰上放置30min,-70℃冻存过夜,次日做好相应标记放入液氮保存,利用台盼蓝拒染法[26]对冻存的细胞活性检测。按照细胞存活率=活细胞/(活细胞+死细胞)×100%,计算细胞存活率。(2)从液氮中取出冻存的细胞,37℃解冻,将冻存细胞移至15 mL离心管中,1000 r/min 离心5min,弃上清,用10 mL含15%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24h后,传代,利用台盼蓝拒染法对复苏后的细胞活性检测。按照细胞存活率=活细胞/(活细胞+死细胞)×100%,计算细胞存活率。

CCK-8(Cell counting kit-8)比色法检测永生化后的细胞生长曲线取指数生长的长江江豚脐带细胞接种于96孔板中,每孔100 μL细胞悬液,设置5个重复孔,细胞接种密度为2.5×104cell/mL,每孔加入10 μL CCK试剂,培养箱孵育4h后,利用酶标仪450 nm处测定吸光度(A450),以时间为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制永生化后的长江江豚的细胞生长曲线。

荧光报告基因转染永生化细胞为了检验外源基因在永生化细胞系内的表达情况,接种细胞于免疫荧光专用共聚焦培养皿10 mm培养皿,参照Lipofectamine 3000说明书,在1.5 mL EP管中使用100 μL培养基(Gibco 公司)稀释2 μL Lipofectamine 3000 Reagent;另一个EP管中使用100 μL未加血清,抗生素的DMEM培养基(Gibco)稀释1 μg 质粒DNA pEGFP-C1或pERed2-N1。室温静置5min后,将两种溶液混合均匀,制备DNA-脂质体复合物,室温孵育20min后,均匀滴至细胞培养皿中,利用倒置荧光显微镜观察转染后24h、48h和60h的荧光表达,并计算转染效率。

统计学方法对于CCK-8细胞增殖实验,每组实验设置5个重复组,使用GraphPad prism7软件计算每组吸光度的平均值并绘制细胞生长曲线。对于荧光报告基因转染效率,分别找出3个合适视野,数出白光条件下的细胞数量和激发光条件下发荧光的细胞数量,按照转染率=阳性细胞数/总细胞数×100%,计算转染效率。

2 结果

2.1 长江江豚脐带组织原代培养

(1)15d左右组织块出现细胞分离,迁出的细胞围绕组织块呈放射状,细胞堆积过多时,传代。一旦组织块向外迁移细胞已形成,取出组织块,转移到新的培养瓶中,重新接种。接种于培养瓶瓶角的组织块,细胞向外迁移速度和效率高于培养瓶中部的组织块。放置一块酒精消毒的盖玻片于组织块边缘,可加快组织块的黏附和细胞迁移,10—12d可见细胞迁移。(2)使用0.25%胰酶消化法得到的悬液杂质太多,细胞贴壁少,增加胰酶处理时间,细胞贴壁数量增加,细胞未能传代。

2.2 长江江豚成纤维细胞的生长特征和形态学观察

在37℃、5% CO2的培养箱通过原代、传代培养,获得纯化的长江江豚成纤维细胞。长江江豚细胞接种至培养基0.5h开始贴壁,细胞贴壁较牢,多次冲洗也难以脱落,胰酶处理时间久,贴壁细胞呈铺石状,典型的梭形、不规则或多边形,细胞体积较小,边界清楚,核仁清晰(图1)。

2.3 长江江豚脐带成纤维细胞永生化

利用脂质体转染法,将SV40 T antigens转染到长江江豚第三代原代细胞中。10 cm2细胞皿接种不多于2×105cell/mL,pW2-SV40 T antigens质粒为20 μg。转染SV40 T antigens后,12h后部分细胞死亡,转入SV40 T antigens的细胞会形成一个细胞灶,生长加速,占据优势,36h后,可传代。从细胞传代和细胞增殖能力可以判断有部分细胞转染成功,少量的转染细胞快速增殖,占据优势。原代的脐带细胞继续传代培养,细胞生长速度变慢,14代细胞已经老化,死亡,没法传代(图2a)。相比较原代细胞,永生化的细胞生长状态良好,生长速度明显加快,体外可稳定传代40代以上,且增殖能力方面也远远高于原代细胞,说明永生化成功。对于快速增殖的细胞系,选取扩增了15代和20代的细胞系,以原代细胞作为对照,通过PCR来进行鉴定,结果显示:在转染后的细胞系中检测到SV40 T antigens的大T和小T抗原区域的表达(图3),表明SV40 LT antigens已经在细胞中整合。永生化的细胞若未及时传代,细胞会出现老化和生长衰退(图2b)。

图1 长江江豚原代成纤维细胞和永生化细胞(×10物镜)Fig.1 The primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

图2 长江江豚原代成纤维细胞老化细胞(a)和永生化老化细胞(b)(×10物镜)Fig.2 The cellular aging of primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

2.4 永生化后长江江豚脐带细胞冻存前及复苏后的活率

选取永生化后第12代、第15代和第17代江豚成纤维细胞,对冻存前及复苏后的细胞进行细胞重悬,制备细胞悬液,滴加染料,静置时间1—2min,计着色细胞数和细胞总数,制表。由表2可知,复苏24h,细胞冻存复苏率达到90%,冻存前细胞状态良好,复苏之后,细胞状态良好,活力并未有太大改变,不同代数之间无明显差异。

2.5 永生化后的细胞生长曲线

将永生化后江豚成纤维细胞按2.5×104cell/mL接种于96孔板连续培养,利用CCK-8法,每12h测量并记录波长在450 nm处的吸光值,绘制了长江江豚成纤维细胞生长曲线(图4),永生化的成纤维细胞生长曲线呈“S”型,培养1—2d时,细胞数量没有较大变化,此时细胞处于潜伏期;培养3d后细胞开始快速生长,此时进入对数生长期;培养6d时细胞生长开始减缓;培养7—8d时,细胞数量基本维持不变,此时细胞生长进入平台期。

2.6 长江江豚成纤维细胞转染

利用脂质体Lipofectamine 3000将编码红色荧光蛋白的质粒 pERed2-N1和编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-C1转染至长江江豚的脐带成纤维细胞,检测外源基因转染入长江江豚细胞内的基因表达情况。荧光蛋白在细胞核和细胞质中均有稳定表达,细胞核的荧光强度高于细胞质。转染24h仅有少量的细胞能够表达荧光蛋白,48h可观察到较多荧光蛋白,60h可观察到更高密度和亮度的荧光蛋白(图5),转染效率不到15%,这表明长江江豚细胞使用质粒进行基因的过表达效率较低。转染后的细胞形态较转染前有所不同,有拉长变细的趋势,细胞变为圆球状,悬浮状,细胞碎片较多,完整细胞核仁明显。

图3 PCR检测SV40 LT和ST基因Fig.3 Detection of SV40 LT and SV40 ST transcript by PCR

表2 长江江豚不同世代成纤维细胞冻存前和复苏后细胞活率Tab.2 The survival rate before and after cryopreservation of Yangtze finless porpoise fibroblasts at different passages

3 讨论

3.1 构建稳定长江江豚细胞系的意义

长江江豚属于国家级保护动物,因为伦理和法律的原因,对动物机体造成损伤的研究无法开展,生理问题的分子机制仍然知之甚少。细胞是生物体结构和功能的基本单位,在一定培养条件下可视为生命活动的缩影,细胞生物学的先行者Wilson指出:“每一个生物学问题的关键最终必然从细胞中寻找”。建立稳定的长江江豚细胞系,便于利用影像技术进行形态结构分析,使用分子、生化、免疫技术进行物质变化检测,为细胞生理学、细胞免疫学、细胞遗传学等提供稳定均一的研究样品。对江豚敏感病毒培养和鉴定,从微观上对江豚的个体致疾、致危、致死因素及机制的了解提供基础。此外,构建稳定长江江豚细胞系,可以更好地将先进分子技术手段运用于长江江豚的疾病治疗、饲养繁殖等工作中。

3.2 影响长江江豚脐带原代细胞培养的因素

组织块培养和酶消化法是目前最常见的体外细胞培养方法[27]。组织块操作简便,对细胞伤害较小,但是细胞游离出来易堆积,生长周期长[28];酶消化法操作复杂,但是获得细胞快速,细胞多单个或成团,很少成片[29],主要包括中性蛋白酶+胶原酶消化法和胰蛋白酶消化两种方法[30—32]。

图4 长江江豚脐带成纤维细胞生长曲线Fig.4 The growth curve of Yangtze finless porpoise fibroblasts

组织贴壁法,除了新鲜组织外,最为关键是贴壁方法、时间和组织块的大小。高效的贴壁方法是组织原代培养成功的关键。贴壁方法可采用培养瓶倒置-正置法,将组织块均匀铺在培养瓶中,滴1—2滴纯的胎牛血清于组织块,倒置培养瓶,待贴壁后,正置培养皿,添加培养基;贴壁时间过长,组织块易变质,过短加培养基易漂浮,3—4h即可;组织块最适大小约1 mm3,铺盘时组织块密度需适中。组织类型不同,组织块游离出细胞的时间不同,大鼠成骨细胞约3d就从组织块游离[33],驴皮成纤维细胞约15d游离形成原代细胞[34],江豚脐带成纤维细胞约14d组织附近游离出细胞。

图5 脂质体介导的pEGFP-C1和pERed2-N1质粒转染长江江豚永生化细胞(A.比例尺25 μm;B.比例尺75 μm）Fig.5 Liposome-medicated transfection of plasmids pEGFP-C1 and pERed2-N1 intoYangtze finless porpoise fibroblasts(A.Scale bar 25 μm;B.Scale bar 75 μm)

长江江豚的脐带产出需要6—8h,水中浸泡,导致杂菌污染,原代培养的培养基添加两性霉素B和PrimocinTM,可提高原代细胞培养的成功率。

3.3 永生化的长江江豚细胞生物学特征

江豚原代成纤维细胞在体外的生长速度,随着细胞传代次数的增加明显延长,细胞出现凋亡,细胞间隙增大。永生化后的成纤维细胞,经多次细胞传代后细胞形态和状态相对稳定,但细胞也会出现老化和衰退。

3.4 影响细胞永生化的因素

有限的细胞系,体外多次传代易发生遗传性状的改变,小鼠的胚胎成纤维细胞通常只能良好生长5代,5代之后的细胞急剧衰亡[35]。家兔胚胎成纤维细胞在10代以后出现衰老迹象,胞体平铺,伪足增多,生长速度慢[36]。脐带细胞难以培养,一般只能传2—3代,添加L-谷氨酰胺可让人的脐带静脉细胞传至6—7代[37]。利用SV40 T antigens,建立可传代培养25代的人脐静脉内皮细胞细胞系[38]。对于SV40 T antigens诱发的永生化,SV40 T antigens的用量、质粒的浓度和纯度对于转染是否成功有很重要的意义,合适的用量、高浓度高纯度的SV40 T antigens成功概率更大。对于长江江豚细胞系,除脂质体转染外,可使用磷酸钙转染、慢病毒和腺病毒感染等多种方式进行外源基因的过表达或干扰来进行某个基因功能的研究。

鲸类由于物种的特殊性,成功建立的鲸类永生化的细胞系甚少,淡水鲸类细胞系的相关研究更是寥寥无几,脐带作为连接母、胎之间的纽带,对于我们了解母、胎之间的物质运输具有重要意义,本实验借助长江江豚分娩时产出的脐带,成功进行体外培养,并且成功构建了永生化的脐带成纤维细胞系,验证了江豚分娩8h后产出的脐带及胎盘的活性,对长江江豚脐带的体外培养细胞的生物学特性进行了初步探索,旨在为长江江豚的体外培养建立一些细胞学数据,奠基后续胎盘研究以及脐带血的研究,为本物种其他组织体外稳定建系打下基础,仅为其他难以建立的豚类细胞系提供参考。

4 展望

随着海洋研究的深入,分子和生化技术越来越多的应用到鲸类研究中,构建鲸类稳定的细胞系是必然的发展方向。鲸类作为特殊的二次入水的动物,越来越多的证据表明,鲸类在长期的演化过程中,产生了自己独特的适应机制。而长江江豚作为特殊的淡水豚类,可能存在一些不同于海洋豚类的适应机制,而对这些适应机制和相关基因的的研究必然要到细胞中去寻找答案。