（北华大学医学技术学院实验中心，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，严重危害女性健康。乳腺癌的发生发展常受到多种基因的调控（原癌基因的激活和抑癌基因的失活），同时也受到一些表观遗传学因素［DNA甲基化和微小RNA（microRNA，miRNA）等］影响［1-3］。其中DNA甲基化的发生不仅可以影响肿瘤相关基因的表达变化，而且对位于CpG岛附近或位于CpG岛中的miRNA表达产生影响［4-6］。本研究探讨抑制DNA甲基化和siRNA干扰DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b，Dnmt3b）后乳腺癌细胞MCF-7中miRNA和肿瘤相关基因的表达情况，旨在为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞生物学研究所，DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国HyClone公司，转染试剂购于美国QIAGEN公司，RNA提取、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购于日本TaKaRa BIOINC公司，GAPDH抗体、DNA甲基化抗体购于英国Abcam公司，二抗购于中国博士德公司，抗荧光淬灭剂、Hoechst33258购于德国Sigma公司。siRNA由上海吉玛公司合成，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光染色检测MCF-7细胞甲基化水平：将盖玻片过酸处理高压灭菌后，放入24孔板中，接种MCF-7细胞，24 h后实验组分别加入5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR），终浓度分别为5-Aza-CdR 10、5、1 μmol/mL；对照组加入等体积PBS，每24 h加入1次5-Aza-CdR，同时更换培养液，连续处理4 d。4 d后取出盖玻片，PBS清洗3次，用5%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次。用TritonX-100（0.2%）透化40 min，盐酸（4N）酸化30 min，弃去液体后，用Tris盐酸（pH8.0）中和20 min，PBS清洗3次。BSA（1%）4 ℃封闭过夜后，加入适量5-甲基胞嘧啶直接荧光抗体（1%BSA 1∶50稀释），避光放置4 ℃过夜，PBS清洗3次，每次30 min。在适量Hoechst33258染色液（5 mg/L）中避光染色10 min，PBS避光清洗3次，每次5 min。……