田 灿，王美垚，李建林，宋长友，葛家春， 苏胜彦,，唐永凯,

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村 部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081；3.江苏省淡水水产研究所，南京 210017)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)属节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacca)十足目(Decapoda)，俗称河蟹，广泛分布于长江中下游地区，是我国重要的经济型蟹类之一[1]，其营养丰富，肉质鲜美，受到广大消费者的追捧。

氨基酸是合成生物体内蛋白质的原料来源，是重要的营养物质，各氨基酸含量的高低一定程度上决定着其营养价值的优劣[2-3]。生长环境、饲料及养殖方式等不同，其氨基酸含量也会出现一定差异[4-6]。必需氨基酸的组成和比例决定着食物蛋白质的营养价值，其组成越接近人体必需氨基酸，蛋白质营养价值越高[7-8]。基于氨基酸营养评分比较可食部位间的营养差异在白乌鱼(OpniocepnalusargusvarKimnra)[9]、河鲀(Tetraodontidae)[10]、金枪鱼[11]、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[12]、中华绒螯蟹[13-16]等水产动物研究中应用广泛。对中华绒螯蟹氨基酸营养品质的研究主要通过对其不同可食部位的营养价值比较分析[13-15]或者将可食部位混合后对其进行分析[16-18]。主成分分析、聚类分析、判别分析作为优良的多元统计方法在中华绒螯蟹群体间形态[19-20]、品质[21-22]、遗传多样性[23-24]等差异性研究中应用广泛。本研究通过测量江苏省内不同湖泊中华绒螯蟹肌肉组织中的氨基酸含量，采用多元统计方法分析比较中华绒螯蟹群体间氨基酸含量差异性，探究群体间的亲缘关系，以期对中华绒螯蟹群体鉴别提供有效的基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年8月16-20日采集了太湖(T)、阳澄湖(Y)、高邮湖(GY)、固城湖(G)、洪泽湖(H)、长荡湖(C)的野生中华绒螯蟹群体，每个群体采集8个个体(雌雄各半)，活体解剖，躯体经冷冻处理后，精刮取出肌肉组织，避免其他组织污染，并保存于-40 ℃的冰箱中待氨基酸分析。

1.2 氨基酸分析

采用6 mol/L HCl水解法[25]对蛋白样品进行酸水解，并使用Agilent-1100液相色谱仪对其进行氨基酸分析，其中色谱柱为ODS HYPERSIL(250 mm×4.60 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相A：称取6.50 g结晶乙酸钠，加1 000 mL水溶解，200 μL三乙胺，5%醋酸调节pH至7.20±0.05，5 mL四氢呋喃，混合后备用。流动相B：称取6.50 g结晶乙酸钠，加200 mL水溶解，5%醋酸调节pH至7.20±0.05，400 mL乙腈、400 mL甲醇，混合后备用；流速：1.00 mL/min；紫外检测波长：338 nm，262 nm (Pro,Hypro)；样品衍生化：分别取样品溶液1 μL、硼酸缓冲液5 μL混合3次后吸取OPA溶液1 μL，混合15 次，吸取FMOC-Cl溶液1 μL，混合15次，吸取水32 μL，混合5次后直接进样测定；梯度洗脱程序见表1，采用外标法定量。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution mode

1.3 数据处理

采用SPSS23.0软件对6湖泊中华绒螯蟹群体的氨基酸含量进行分析，结果均以平均值±标准误(X±SE)表示。使用Levene’s法进行方差齐性检验，若实验数据不满足齐性方差检验，则对百分比数据进行平方根或者反正弦处理。使用ANOVA对实验数据进行方差分析。氨基酸群体间差异进行单因子方差分析(以每种氨基酸为变量)，显著性水平设为0.05，应用邓肯氏法进行多重比较。

运用主成分分析、聚类分析，逐步判别分析方法对中华绒螯蟹肌肉组织氨基酸含量进行分析，判别准确率的计算参照李思发等[26]的方法。数据处理采用Excel和SPSS 23.0软件。

1.4 氨基酸营养价值评价

根据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)建议的氨基酸评分标准和鸡蛋蛋白的氨基酸模式进行比较[27-28]，按下列公式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)。

式中：n为比较的必需氨基酸数目(n=7)；a～i为试验蛋白质的必需氨基酸含量；ae～ie为鸡蛋蛋白质的氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 中华绒螯蟹氨基酸含量间差异

从中华绒螯蟹雌雄群体肌肉中均分离出了17种氨基酸(色氨酸在盐酸水解过程中与含醛基化合物反应生成黑色物质，从而被破坏)，见表2、3。包括9种必需氨基酸(EAA)：苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)；8种非必需氨基酸(NEAA)：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)。从单个氨基酸含量来看，各群体间Glu，Lys含量均较高，Cys含量最低。

雌蟹中(表2)，H群体总氨基酸(TAA)、EAA、NEAA含量均最高，其中TAA、EAA含量均显著高于C、T、Y群体，与G、GY群体差异不显著。NEAA含量显著高于C、Y群体，与G、GY、T群体差异不显著。雄蟹中(表3)，GY群体TAA、EAA、NEAA含量均最高，且显著高于Y、H、T群体，与C、G群体差异不显著。

由表2可知，雌蟹群体肌肉中EAA/TAA、EAA/NEAA均为C，G群体显著高于GY、H、Y群体，T群体显著低于其他群体，C、G群体无显著性差异，GY、H、Y群体无显著性差异；雄蟹群体中(表3)EAA/TAA、EAA/NEAA 均为C显著高于H群体，G、GY、T、Y群体间差异不显著。

表2 6个产地中华绒螯蟹雌性群体肌肉中主要氨基酸组成Tab.2 The amino acids contents in muscle of the female E.sinensis from six populations %

表3 6个产地中华绒螯蟹雄性群体肌肉中主要氨基酸组成Tab.3 The amino acids contents in muscle of the male E.sinensis from six populations %

% 续表3

2.2 基于氨基酸含量的主成分分析、聚类分析

基于6个湖泊中华绒螯蟹群体各氨基酸含量进行主成分分析、聚类分析。雌雄群体前2个主成分累计贡献率均超过70%(表4)，包含了总变异的绝大部分，表明可以利用这两个相互独立的因子来概括各群体间氨基酸含量差异。提取第1主成分中贡献率前十的因子作为散布图数据，图1为中华绒螯蟹雌雄群体第1、2主成分散布图及聚类分析图。

雌雄群体氨基酸主成分分析和聚类分析结果与其多重比较结果相似。雌蟹中，H、C、Y群体与其余群体重叠程度均较低，差异较明显，GY、T群体重叠程度较高不易区分，且与G群体有一定重叠(图1.a)。其聚类分析结果与其散布图相似，为T、GY群体欧式距离最短首先聚为一支，然后与G群体聚为一支，之后再与H群体聚为一支，但聚类分析将C和Y聚为一支(图1.b)。雄蟹中，H群体与其余群体重叠程度较低，差异明显，Y、T群体重叠程度较高，GY、C、G群体重叠程度较高，不易区分(图1.c)。聚类分析将H、Y、T群体聚为一支，GY、C、G聚为一支(图1.d)。

2.3 基于氨基酸含量的判别分析

中华绒螯蟹6个地理湖泊群体判别分析中，F检验判别效果均较好。雌蟹中，T、C、H、G、Y、GY群体判别准确率分别为100.00%、100.00%、75.00%、75.00%、75.00%、50%，综合判别准确率为79.16%(表5)。雄蟹中，除GY群体判别准确率为75.00%外，其余群体均为100.00%，综合判别准确率为95.83%(表6)。

表4 6个产地中华绒螯蟹雌雄群体氨基酸特征 因子负荷矩阵及主成分贡献率Tab.4 Component matrix and contributive proportions of principal components on amino acids of female and male E.sinensis

图1 6个产地中华绒螯蟹群体氨基酸主成分分析和聚类分析图Fig.1 Principal component analysis and cluster analysis of six E.sinensis populations a：主成分分析(♀)，b：聚类分析(♀)，c：主成分分析(♂)，d：聚类分析(♂)

表5 6个产地中华绒螯蟹雌性群体氨基酸判别分析Tab.5 Discriminant analysis of amino acids in female populations of E.sinensis from six habitats %

2.4 必需氨基酸组成评价

按全鸡蛋标准计算氨基酸评分结果见表7，表8。雌蟹中，中华绒螯蟹群体肌肉组织AAS除Met+Cys外，均大于1；CS值均大于或接近0.5。综合EAAS、CS值可知Met+Cys为其限制性氨基酸，H、G群体EAAI指数与GY群体差异不显著，与C、T、Y群体具有显著性差异，洪泽群体AAS、CS、EAAI值最高。雄蟹中(表7)除GY群体AAS值均大于1外，其余群体Met+Cys均小于1，CS值大于或接近0.5，GY、C、G群体EAAI指数显著高于H、T群体，G、Y群体差异不显著，GY群体AAS、CS、EAAI值高于其他群体，且无限制性氨基酸，Met+Cys为C、G、H、T、Y群体的限制性氨基酸(表8)。

表6 6个产地中华绒螯蟹雄性群体氨基酸判别分析Tab.6 Discriminant analysis of amino acids in male populations of E.sinensis from six habitats %

表7 6个产地中华绒螯蟹雌性群体肌肉组织中必需氨基酸评分Tab.7 The essential amino acids score (EAAS) of muscle of female E.sinensis from six populations

表8 6个产地中华绒螯蟹雄性群体肌肉组织中必需氨基酸评分Tab.8 The essential amino acids score (EAAS) of muscle of male E.sinensis from six populations

2.5 肌肉组织支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值(F值)

中华绒螯蟹肌肉中的氨基酸种类齐全，F值比较高，具有较高的营养价值。雌蟹中，T高于Y群体必需氨基酸F值，分别为2.68、2.65，符合FAO/WHO模式(2.63)。C、G、H、GY群体F值分别为2.46、2.38、2.34、2.34、2.65，均略低于FAO/WHO模式，但高于鸡蛋蛋白(2.03)。雄蟹中，C、G、GY、H、T、Y群体F值分别为2.43、2.35、2.33、2.33、2.59、2.61，均未达到FAO/WHO模式，但高于鸡蛋蛋白。

3 讨论

3.1 中华绒螯蟹肌肉组织氨基酸组成分析

本研究对6个湖泊中华绒螯蟹肌肉组织中氨基酸组成进行分析，结果显示，6个湖泊中华绒螯蟹均检测出17种常规氨基酸，且谷氨酸、赖氨酸含量在各群体中均较高。王潇等[13]研究表明谷氨酸含量在中华绒螯蟹蟹膏、肌肉组织中均较高。陈志强等[15]研究发现固城湖中华绒螯蟹肌肉组织中谷氨酸、赖氨酸含量较高。谷氨酸具有解毒和刺激脑部兴奋等作用[29]，而赖氨酸则是食物中最容易缺乏的氨基酸，具有促进钙吸收，缓解疲劳等作用[30]。因此，江苏省内6个湖泊中华绒螯蟹具有良好的保健作用，对人体健康有利。

研究表明产地、养殖方式等的不同，其氨基酸含量等也会出现不同程度的差异[4-5]。本研究对6个湖泊中华绒螯蟹群体肌肉组织中氨基酸含量进行数据分析发现各群体间氨基酸含量差异显著，其中雌雄群体均显示阳澄湖与固城湖群体肌肉组织中各氨基酸指标均具有显著性差异(P<0.05)，此结果与王潇等[13]在对长江水域、辽河(入海口)和黄河(中上游)等水域中华绒螯蟹雌性群体营养成分及风味成分差异性研究的结果相似。

聚类分析可以直观地表现出研究对象的差异程度，聚类的先后顺序反映群体间亲缘关系的远近[31]。主成分分析是将参数综合成少数因子来说明不同群体间差异性，并可以根据不同群体的主成分值找出各群体在主成分值上差异较大的参数[32]。王馨雨等[33]采用味道强度值(TAV)、主成分分析法及聚类分析法对不同品种百合鳞茎中游离氨基酸(Free amino acids，FAAs)综合品质的差异进行综合评价，结果显示聚类分析结果与主成分综合分析结果较一致，可反映出不同百合种质之间的差异。本研究中，综合主成分分析和聚类分析发现中华绒螯蟹雌雄群体主成分分析散布图与聚类分析所得群体间亲缘关系远近结果一致，一定程度上说明群体间氨基酸含量出现了差异，并将各群体间氨基酸差异更直观地呈现出来。判别分析是群体鉴定的常用方法，它根据已知条件建立相应的判别函数，并根据所构建数据进行分类[34]，郭爽等[35]对每个品种和产地的苹果鲜榨浊汁的氨基酸组分及含量建立判别函数发现不同品种，不同产地苹果浊汁的样品间差异性均较大，分别获得了77.8%和 81.8%的判别准确率，实现了品种及产地间的差异性分析。本研究基于氨基酸含量，对6个湖泊群体进行产地判别分析，结果显示雌雄群体间综合判别准确率分别为79.16%，95.83%，可见能够通过中华绒螯蟹群体间的氨基酸含量差异对其群体产地进行有效的判别。

3.2 不同产地中华绒螯蟹肌肉组织中氨基酸营养价值

蛋白质营养价值的高低，不仅在于其所含氨基酸的种类，必需氨基酸的含量及比例，是评价氨基酸营养价值的重要指标[5]。张彤晴[17]对不同增养殖水体长江水系中华绒螯蟹必需氨基酸的CS、AAS、EAAI以及人体所需支芳值进行比较发现在不同增养殖水体中长江天然雄蟹、湖泊放流雌蟹可食部位营养品质最好。根据FAO/WHO的理想模式，组成蛋白质的氨基酸中EAA/TAA在0.40左右，EAA/NEAA在0.60以上[36]，EAAS高于1.00，CS值高于0.50，则被认为是质量较好的蛋白质，容易被完全吸收，其营养价值较高[37]。EAAI可反映必需氨基酸含量与标准蛋白质含量的接近程度[38]，EAAI 高于0.95，表示为优质蛋白源；EAAI 0.86-0.95，表示为良好蛋白源；EAAI 0.75-0.86，表示为可用蛋白源；EAAI 低于 0.75 则表示为不适蛋白源[39-40]。本研究对6个湖泊中华绒螯蟹肌肉组织中氨基酸的各项指标进行分析发现，中华绒螯蟹雌雄群体中，EAA/TAA、EAA/NEAA、AAS、CS值均接近或符合FAO/WHO标准模式，均为优质蛋白源或良好蛋白源，除高邮湖雌蟹无限制性氨基酸外，其余群体限制性氨基酸均为蛋氨酸+半胱氨酸，洪泽湖雌蟹、高邮湖雄蟹营养价值最高。朱青顺等[18]对江苏太湖、阳澄湖、滆湖、长荡湖、固城湖、洪泽湖、高宝湖、大纵湖八大养殖品牌中华绒螯蟹测试分析结果显示，滆湖群体中华绒螯蟹EAAI指数最高，洪泽湖群体最低，蛋氨酸+半胱氨酸为第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸为缬氨酸或者异亮氨酸，与本研究结果均不太符合，可能是因为本研究以中华绒螯蟹肌肉组织为对象对其氨基酸营养价值进行评价，而朱青顺等[18]将中华绒螯蟹可食部位混合所得。王秀莉等[41]对安徽3类淡水水产品品质进行分析发现，中华绒螯蟹的氨基酸含量分布在蟹肉、蟹黄和蟹膏中具有明显差异。支链氨基酸具有降低胆固醇和抑癌保肝等功能，人类的正常F值范围为3.00～3.50，当肝脏受到损伤时，其值范围降为1.00～1.50[42]。本研究测得6湖泊中华绒螯蟹必需氨基酸F值与人体所需进行比较发现，中华绒螯蟹雌雄群体F值均高于人体肝脏受损伤时的F值范围，表明6湖泊中华绒螯蟹均具有良好的保肝和降低胆固醇作用。

综上，江苏6个地理湖泊中华绒螯蟹雌雄群体肌肉组织中氨基酸种类齐全，氨基酸含量存在显著性差异，且氨基酸之间的比例适宜，F值较高，具有较高的营养价值，均为优质或良好蛋白源，洪泽湖雌蟹，高邮湖雄蟹肌肉组织中氨基酸营养价值最高，基于中华绒螯蟹群体间的氨基酸含量可对其群体进行有效的判别；在后续研究中，我们还需通过增加样本量及更多地理群体，完善统计方法，增加遗传因素分析，增加中华绒螯蟹可食部位比较等，以期更全面地了解中华绒螯蟹群体间氨基酸含量及营养价值差异性，将有助于进一步开展中华绒螯蟹群体鉴别方法，为中华绒螯蟹氨基酸营养价值评价等研究提供数据支撑。