李 玲，朱梦晨，李 点，杨婷婷，邱 婷，王 健

0引言

随着现代生活计算机、手机的普及，外界环境风沙、烟尘的侵袭，隐形眼镜和冷暖空调的广泛使用，干眼的发病率呈逐年升高趋势[1-2]。因此，对干眼发病机制与药物防治的研究具有重要的现实意义。基于泪腺细胞原代培养构建稳定的干眼细胞模型成为本课题组研究的首要工作，然而，干眼细胞模型虽有报道，但不尽详细，模型的稳定性也有待考究，不利于以原代泪腺细胞为工具的相关的基础和临床研究。因此，本研究使用原代培养兔泪腺上皮细胞，采用脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)干预的方式构建干眼细胞模型，并通过免疫荧光、流式和ELISA方法，对原代细胞进行活性和纯度检测，并对比两种建模方式的差异，为进一步筛选干眼防治药物和评价药效学奠定基础。

1材料和方法

1.1材料新西兰白兔，雄性，12只，90日龄，1～1.2kg，普通级，由湖南中医药大学动物实验中心提供(SPF级)。湖南许可证号：SCXK(湘)2013-0004。饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。所有动物实验操作均经过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审议并通过。流式细胞仪(美国Beckman，coulter-cytexpert)，细胞培养箱(美国Thermo，3111)，台式高速冷冻离心机(美国Thermo)，ELX800-酶标仪(美国Bio-tek，ELX800)，微量移液器(德国Eppendorf)；FBS、DMEM/F12的培养液购自美国Gibco，Ⅱ型胶原酶(V900892)、LPS(Sigma，L2880)，TNF-α因子(美国Immunochemistry，6519)，Pan-cytoeratin抗体(bs-1712R)、FITC-羊抗兔IgG(bs-0370R)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BA00101)、CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒(Biosharp，BS350A)。

1.2方法

1.2.1完全培养液的配置取10mL FBS、40mL DMEM/F12基础培养基混合，配成含20%FBS的DMEM/F12完全培养液。Ⅱ型胶原酶：0.01gⅡ型胶原酶粉溶于基础培养基中定容至5mL，配制成2g/L应用液。

1.2.2泪腺上皮细胞的原代培养[3-4]随机选取1只雄兔，选用20%乌拉坦1.5g/mL耳缘静脉注射，在超净工作台上常规无菌操作，用眼科剪取出泪腺组织。……