张海英, 张文馨, 赵文静, 李 伟

（1. 吉林大学基础医学院 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春 130021；2. 吉林省肝胆病医院中心实验室，吉林 长春 130062）

哺乳动物细胞可通过线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS） 和糖酵解2 种糖代谢方式供应能量ATP，常氧情况下，正常细胞糖代谢主要由线粒体OXPHOS 产生ATP 以提供代谢活动所需要的能量。WARBURG 等［1］认为：肿瘤细胞由于线粒体呼吸缺陷，即使在有氧环境中也通过糖酵解供应大部分ATP。但近期研究［2-4］表明：多数肿瘤细胞线粒体是完整的，即使有些细胞具有更高的糖酵解，但仍保持线粒体呼吸，在某些癌症（包括白血病、淋巴瘤、胰腺导管腺癌、高OXPHOS 亚型黑色素瘤、子宫内膜癌和高侵袭性肿瘤等）中线粒体OXPHOS 发挥重要作用，OXPHOS 是抗肿瘤治疗的新靶点。五倍子酸（3，4，5-三羟基苯甲酸，gallic acid，GA） 也称为没食子酸或棓酸，是一种天然多酚类化合物，已证实其对多种肿瘤细胞系具有抗肿瘤活性［5-8］。但GA 对肝癌细胞线粒体OXPHOS 的抑制作用尚未见报道。本研究以人肝癌HepG-2 细胞为模型，首次采用Seahorse Extracellular Analyzer 细胞能量代谢分析仪检测GA 作用下HepG-2 细胞量代谢动态全过程，分析细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、线粒体细胞色素C（cytochrome C，CytC） 和细胞中ATP 水平的变化，从细胞能量代谢和与之密切相关的细胞器线粒体出发，探讨GA 抗肝癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人肝癌HepG-2 细胞（江苏凯基生物技术股份有限公司），GA （美国Chromadex 公司），线粒体膜电位检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、线粒体分离试剂盒和胞浆蛋白抽提试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司），CytC 单克隆抗体和β-actin 抗体（美国SAB 公司），化学发光检测试剂盒（上海天能科技有限公司），胎牛血清和DMEM 培养基（美国Gibco 公司），线粒体压力检测试剂盒（美国Seahorse Bioscience 公司），ATP 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司），全波长多功能酶标仪（美国Perkinelmer 公司），高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司），电泳仪和半干转印槽转膜仪（美国Bio-Rad 公司），流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 MTT 法检测HepG-2 细胞存活率参照文献［9］方法，HepG-2 细胞以 每 孔100 μ L （1×105mL－1） 接种到96 孔细胞培养板，培养24 h 后分为对照组和不同浓度GA 组（加入终浓度0、3.125、 6.250、 12.500、 25.000、 50.000 和100.000 mg·L－1GA［10］），每个浓度设置4 个复孔，作用24、48 和72 h 后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h 后终止培养弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO 充分溶解紫色结晶物，酶标仪490 nm 下测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组A 值－空白对照组A 值）/（对照组A 值－空白对照组A 值）×100%。

1.3 能量代谢分析仪检测细胞线粒OXPHOS 水平对数生长期HepG-2 细胞接种于Seahorse XFp专用板（8 000 个/孔），培养24 h 后，分为对照组及6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 组，分别加入 含0、 6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培养基作用24 h，更换能量分析专用培养液，按照线粒体压力测定试剂盒说明书配制试剂，能量代谢分析仪实时检测细胞线粒体耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），代表细胞线粒体OXPHOS 活性，并根据OCR 值分析各组HepG-2 细胞的基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP 产生量。

1.4 流式细胞术检测细胞MMP每孔1×106个HepG-2 细胞接种于6 孔细胞培养板，培养24 h 后分组同“1.3”，分别加入含（0、6.25、12.50 和25.0 mg·L－1）GA 的DMEM 培养基作用12 h，收集各组细胞按照Rhodamine123 染色试剂盒操作，激发波长505 nm，发射波长530 nm，流式细胞仪测定线粒体内Rhodamine123 的荧光强度，以强荧光细胞百分率表示MMP。

1.5 比色法检测细胞中ATP 水平细胞分组及处理同“1.4”，离心收集各组细胞，加入提取液，冰浴超声波破碎5 min，4 ℃、12 000 r·min－1离心3 min，取上清，置冰上检测。严格按照ATP 水平测定试剂盒操作，分光光度计在波长636 nm 处测定各管A 值。ATP 水平（μmol·g－1prot）=（测定A 值－对照A 值） / （ 标 准 A 值 － 空 白A 值）×标准品浓度（1×103μmol·L－1）× 样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白浓度（g·L－1）。

1.6 Western blotting 法检测细胞胞浆和线粒体中CytC 蛋白表达量细胞分组同“1.4”，收集GA处理48 h 的HepG-2 细胞，按照线粒体分离试剂盒操作制备线粒体裂解液，按照细胞胞浆蛋白抽提试剂盒操作制备胞质部分裂解液，BCA 法测定蛋白浓度。取20 μg 蛋白样品上样，经SDS-PAGE 电泳分离后，半干转蛋白至硝酸纤维素膜（NC） 上，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，ECL 试剂进行化学发光。胶片于暗室曝光后，扫描并观察结果。

1.7 吖啶橙染色观察细胞形态表现细胞分组同“1.4”，收集GA 处理48 h 的HepG-2 细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×107mL－1，95 μL 细胞悬液加入5 μL 吖啶橙储存液（0.1 g·L－1），染色15 min 后取1 滴细胞悬液点于洁净玻片上，盖玻片封片，荧光显微镜下观察细胞形态表现。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率每孔1×106个HepG-2 细胞接种于6 孔细胞培养板，24 h 后分为对照组及6.25、12.50 和25.00 mg·L－1组，更换含GA 0、 6.25、 12.50 和 25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培养基作用48 h，离心收集细胞，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。每个样品加入5 μL Annexin V 溶液和5 μL PI 溶液避光孵育15 min，最后各加入400 μL PBS缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡。早期细胞凋亡率=早期凋亡细胞数/总细胞数×100%，晚期细胞凋亡率=晚期凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.9 统计学分析采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析。各组HepG-2 细胞存活率、基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力、ATP 产生量、MMP 和ATP 水平以及细胞凋亡率均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组HepG-2 细胞存活率对照组HepG-2 细胞生长活跃，经不同浓度GA 处理24、48 和72 h后，各剂量GA 组HepG-2 细胞存活率均不同程度降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈明显的时间和浓度依赖性。见图1。

2.2 各组HepG-2 细胞线粒体OXPHOS与对照组比较，不同浓度GA 组HepG-2 细胞基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP 产生量均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图2。

图1 GA 作用不同时间各组HepG-2 细胞存活率Fig.1 Survival rates of HepG-2 cells in various groups after treated with GA for different time

图2 各组HepG-2 细胞线粒体OXPHOSFig.2 Mitochondrial OXPHOS of HepG-2 cells in various groups

2.3 各组HepG-2 细胞MMP 和ATP 水平GA 作用24 h，HepG-2 细胞中强荧光细胞百分率逐渐减少。6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 组强荧光细胞 百 分 率 即MMP 分 别 为（73.12±4.61）%、（65.49±4.32）%和（38.64±5.93）%，与对照组［（94.38±2.18）%］ 比较均明显降低（P＜0.05），见图3。与对照组比较，不同浓度GA 组细胞 中ATP 水 平 均 明 显 降 低（P＜0.05 或P＜0.01），6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 组 细胞中ATP 水平分别降低至61.11%、45.56% 和30.24%，见图4。

图3 各组HepG-2 细胞MMPFig.3 MMP of HepG-2 cells in various groups

图4 各组HepG-2 细胞ATP 水平Fig. 4 Levels of ATP in HepG-2 cells in various groups

2.4 各组HepG-2 细胞胞浆和线粒体中Cyt C 表达量对照组HepG-2 细胞胞浆无Cyt C 特异条带，不同浓度GA 组细胞胞浆均检测到Cyt C 表达，随着GA 浓度的增加胞浆中Cyt C 表达量明显增加；各组细胞线粒体均有Cyt C 特异条带出现，不同浓度GA 组线粒体中Cyt C 表达量随着GA 剂量的增加呈降低趋势。见图5。

图5 各组HepG-2 细胞胞浆和线粒体中Cyt C 蛋白表达电泳图Fig. 5 Electrophoregram of expressions of Cyt C protein in cytoplasm and mitochondria of HepG-2 cells in various groups

2.5 各组HepG-2 细胞凋亡形态表现及凋亡率对照组HepG-2 细胞形态饱满，细胞质呈均匀弥散绿色荧光，细胞核形态规则； GA 处理48 h 后不同浓度GA 组HepG-2 细胞体积缩小，细胞核碎裂，染色质凝集，呈凋亡细胞的形态学变化（图6）。进一步采用Annexin V-FITC/PI 双染定量检测细胞 凋 亡 率，GA 作 用48 h 后，6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 组 早 期 细 胞 凋 亡 率 分 别 为（10.8±0.8）% 、（18.7±0.7）% 和 （26.9±0.8）%，与对照组［（0.2±0.1）%］比较明显升高（P＜0.05）；晚期细胞凋亡率分别为（1.8±0.4）%、（11.2±0.6）%和（20.1±0.5）%，与对照组［（0.3±0.1）%］比较明显升高（P＜0.05）。见图7。

图6 吖啶橙染色观察各组HepG-2 细胞形态表现（×100）Fig.6 Morphology of HepG-2 cells in various groups observed by acridine orange staining（×100）

图7 流式细胞术检测各组HepG-2 细胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of HepG-2 cells in various groups detected by flow cytometry

3 讨 论

全球50% 以上的新发和死亡肝癌患者在中国［11］。肝癌起病隐匿，外科手术是首选治疗方法，但能获得手术切除机会的患者仅占20%～30%［12］。肝癌患者术后5 年复发率高达50%～70%，存活率仅为20%～30%［13］。因此研发高效、低毒的抗肝癌药物十分迫切［14-15］。本研究利用人肝癌HepG-2细胞，从细胞增殖、线粒体OXPHOS 抑制和细胞凋亡等方面观察GA 对HepG-2 的抗肿瘤作用及潜在机制。

近年来，多个科研团队［16-18］将OXPHOS 抑制剂用于肿瘤治疗均取得了满意的疗效。ZHANG 等［16］研究发现：OXPHOS 抑制剂IACS-010759 在体内体外可明显抑制伊布替尼耐药的套细胞淋巴瘤细胞的生长。ZHAO 等［17］研究发现：维生素E 衍生物ESeroS GS 可通过下调己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）及具有电子传递功能的复合物Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ（complexⅡ/Ⅲ/Ⅳ） 等的表达，降低乳腺癌细胞MMP，同时抑制乳腺癌细胞糖酵解和OXPHOS，从而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；范霞霞等［18］研究表明：天然二萜衍生物Jar-TTA 通过双重抑制糖酵解和线粒体OXPHOS诱导食管癌细胞凋亡，其机制可能与Jar-TTA 降低食管癌细胞MMP 进而干扰线粒体OXPHOS 功能，以及下调葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLIT4） 和乳酸脱氢酶A（L-actate dehydrogenase A chain，LDHA）而抑制葡萄糖摄取和糖酵解进程有关。线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM） 是OXPHOS 产生ATP 的部位，线粒体基质中的三羧酸循环利用葡萄糖的代谢产物产生烟酰胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），并将其提供给位于线粒体内膜的电子传递链（electron transport chain，ETC），线粒体ATP 合成酶利用ETC 产生的质子梯度作为驱动力催化ADP 磷酸化生成ATP［19-20］。本研究中首先采用MTT 法检测GA 对HepG-2 细胞增殖的影响，结果显示：在体外GA 可有效抑制HepG-2 细胞增殖；细胞能量代谢分析仪检测GA可明显抑制HepG-2 细胞线粒体OXPHOS 活性，与对照组比较，GA 处理组HepG-2 细胞基础有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP 产生量均明显降低。

IMM 的完整和非渗透性保证了线粒体功能的正常［21］，MMP 反应了沿着电子传递链电子传递而形成的质子梯度，是线粒体功能完整性的指标，其完整性主要由ETC 和ATP 合酶维持［22］。本研究结果显示：GA 能明显降低HepG-2 细胞MMP，减少ATP 产生。HepG-2 细胞MMP 下降，导致线粒体通透性增加，存在于线粒体中的Cyt C 释放入胞浆，Cyt C 启动细胞凋亡线粒体信号转导通路，最终激活半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）级联反应诱导HepG-2细胞凋亡［23-25］。本研究中吖啶橙染色和流式细胞仪检测结果显示： 不同浓度GA 在体外可诱导HepG-2 细胞凋亡，不同浓度GA 作用HepG-2 细胞48 h 后，早期细胞凋亡率达到和晚期凋亡细胞率达到均明显提高。

综上所述，本研究将细胞能量代谢与抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡相关联，阐明GA 可能通过降低HepG-2 细胞MMP，抑制线粒体OXPHOS 功能，诱导肿瘤细胞凋亡。GA 是否对线粒体中具有电子传递功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ具有调控作用需进一步研究。