刘静乔, 孟亚丽, 徐淑稳, 王云灿, 王 娜, 王玉静

（1. 河北医科大学第一医院妇科，河北 石家庄 050031；2. 河北医科大学第一医院超声科，河北 石家庄 050031）

宫腔黏连（intrauterine adhesion，IUA） 是由于宫腔内手术操作和细菌感染等原因导致子宫腔、子宫峡部及子宫颈管损伤引起腔壁相互黏连。IUA患者常表现为月经紊乱、周期性腹痛、不孕和自然流产，严重影响患者身心健康［1］。目前对IUA 的治疗主要以宫腔镜IUA 分离术为主，术后使用雌激素、宫内置入宫内节育器和干细胞治疗，但复发率较高，且具有一定的局限性［2］。近年来，中药以其安全性高和疗效广泛的特点受到学者关注，在治疗IUA 方面具有明显效果［3-4］。唇形科植物丹参具有活血调经、排脓消肿的功效，临床常应用于血瘀经闭和月经不调等妇科疾病［5］。研究［6］表明：丹参具有明显的类雌激素治疗作用，具有辅助治疗绝经性疾病的用途。丹参酮ⅡA 是丹参提取物脂溶性菲醌化合物总丹参酮中的主要有效成分。目前国内外尚未发现关于丹参酮ⅡA 对子宫内膜容受性影响相关机制的研究。本研究通过建立实验性大鼠IUA模型，通过观察丹参酮ⅡA 对大鼠子宫内膜容受性相关指标整合素αVβ3 和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）表达水平的影响，探讨其预防IUA 的效果及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性SD 大鼠50 只，15 周龄，体质量（250±20） g，购自河北以岭医药研究院有限公司，动物使用许可证号：SYXK（冀） 2015-0064。室温饲养，实验前适应性饲养1 周，期间自由摄食和饮水。

1.2 主要试剂和仪器丹参酮ⅡA（中国药品生物制品检定所），HE 染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Masson 染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），鼠抗人整合素αVβ3 单克隆抗体（美国BD 公司），兔抗人LIF 多克隆抗体（美国Abbiotec 公司）。HY-1508 型石蜡切片机（上海华岩仪器设备有限公司），CX43 型生物显微镜（日本Olympus公司），9700型PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.3 实验动物造模及分组50 只雌性SD 大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量丹参酮ⅡA 组、中剂量丹参酮ⅡA 组和高剂量丹参酮ⅡA 组，每组10 只。除对照组外，其余各组大鼠根据文献［7］方法，在无菌条件下采用刮宫法建立大鼠IUA 模型：腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，解剖下腹部，暴露双侧子宫，于子宫分叉右上方行切口，行刮宫法，至子宫四壁感觉粗糙时，停止操作，缝合切口，给予青霉素消炎。造模7 d 后，低、中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠分别灌胃给予剂量为5、10和20 mg·kg－1的丹参酮ⅡA，对照组和模型组大鼠给予等体积生理盐水，每天1 次，连续给药14 d。

1.4 HE 染色观察大鼠子宫内膜组织病理形态表现末次给药后24 h 取各组大鼠子宫内膜组织，采用10%甲醛固定，无水乙醇脱水，石蜡包埋，行组织切片，厚度为4 μm，漂洗，行HE 染色，采用苏木精染色5 min，置入含1% HCl 的无水乙醇中固定，采用伊红染色4 min，清洗，置于高倍镜（×200）下观察，计数子宫内膜组织中腺体数，取平均值。

1.5 Masson 染色检测大鼠子宫内膜纤维化面积比每组随机选取3 张大鼠子宫内膜组织切片，行Masson 染色，在高倍镜（×200）下随机选取6 个视野，应用图像分析系统Image-Pro Plus 6.0 计算子宫内膜纤维化面积比，子宫内膜纤维化面积比=子宫内膜间质纤维化面积/视野总面积×100%，取平均值。

1.6免疫组织化学法检测大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平取各组大鼠子宫内膜组织切片，常规脱蜡至水，采用3%H2O2灭活内源性酶，热修复抗原，加稀释一抗整合素αVβ3（1∶100） 和LIF（1∶100），4℃下过夜，加入二抗，于37℃孵育30 min，加入辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白，于37℃孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，阳性细胞呈棕黄色，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。置于高倍镜（×400）下随机选取6 个视野，采用图像分析系统Image-Pro Plus 6.0分别测定整合素αVβ3 和LIF 阳性染色区域的平均吸光度（A）值，以A 值代表目的蛋白表达水平。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表达水平取各组大鼠子宫内膜组织，按照总RNA 提取试剂盒说明书步骤提取总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA 浓度，按反转录试剂盒说明书方法将RNA 反转录成cDNA，以cDNA 为模板，进行实 时 荧 光 定 量PCR 扩 增。 αV β3： 上 游 引 物5′-TCATGGACTCCTGTGCCCCGTGGCT-3′，下游 引 物 5′-CCTCCAGCTGCGGTGGACTGAGCCT-3′，345 bp； LIF： 上 游 引 物 5′-GGGATTGTGCCCCTACTGC-3′ ，下游引物5′-GCTGAGGAGGCCCCTCATGAC-3′，429 bp； β-actin：上游引物5′-ATGCCATCCTGCGTCTG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′，542 bp。扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃、20 s，60 ℃、33 s，72 ℃、30 s，共35 个循环。整合素αVβ3 mRNA 和LIF mRNA 引 物 均 根 据 标 准RT-PCR 引物设计原则，由上海生工公司设计并合成。以β-actin 为内参，采用2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA 相对表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠子宫内膜组织中腺体数、纤维化面积比、整合素αVβ3 和LIF 蛋白及mRNA 表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠子宫内膜组织病理形态表现对照组大鼠宫腔结构完整，腺体丰富，细胞排列整齐；与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中腺体减少，细胞排列紊乱，纤维化增生；与模型组比较，低、中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠宫腔结构明显改善，子宫内膜增厚，细胞排列较整齐，纤维细胞减少。与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中腺体数明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜腺体数明显增加（P＜0.05）；与低剂量丹参酮ⅡA 组比较，中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中腺体数明显增加（P＜0.05）。见图1 和表1。

图1 各组大鼠子宫内膜组织病理形态表现（HE,×200）Fig.1 Pathomorphology of endometrium tissue of rats in various group(HE,×200)

表1 各组大鼠子宫内膜组织中腺体数Tab. 1 Number of endometrial glands of rats in various groups

表1 各组大鼠子宫内膜组织中腺体数Tab. 1 Number of endometrial glands of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose Number of endometrial glands 29.31±5.26 5.60±1.51*12.84±3.62△21.50±3.01△#23.41±3.45△#

2.2 各组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比明显降低（P＜0.05）；与低剂量丹参酮ⅡA 组比较，中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比明显降低（P＜0.05）；与中剂量丹参酮ⅡA 组比较，高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比明显降低（P＜0.05）。见图2 和表2。

图2 各组大鼠子宫内膜组织Masson 染色结果（×200）Fig.2 Results of Masson staining of endometrium tissue of rats in various groups(×200)

2.3 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF蛋白表达水平整合素αVβ3 和LIF 主要表达于子宫内膜组织中腺上皮及腔上皮细胞细胞质和细胞膜。与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与低剂量丹参酮ⅡA 组比较，中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与中剂量丹参酮ⅡA 组比较，高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见表3 和图3。

表2 各组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比Tab. 2 Fibrosis area ratios of endometrium tissue of rats in various groups

表2 各组大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比Tab. 2 Fibrosis area ratios of endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose Fibrosis area ratio 5.32±0.60 66.84±5.89*40.20±4.51△28.87±3.52△#19.74±3.17△#O

2.4 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA表达水平与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P＜0.05）；与低剂量丹参酮ⅡA 组比较，中和高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；与中剂量丹参酮ⅡA 组比较，高剂量丹参酮ⅡA 组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）。见表4。

表3 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF proteins in endometrium tissue of rats in various groups

表3 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF proteins in endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose αVβ3 protein 33.82±1.83 5.20±0.84*LIF protein 29.20±1.90 4.01±0.63*13.59±1.22△19.41±1.35△#23.01±1.84△#O 11.52±1.41△24.41±1.60△#28.99±1.63△#O

3 讨 论

图3 各组大鼠子宫内膜组织免疫组织化学染色结果（×400）Fig.3 Results of immunohistochemical staining of endometrium tissue of rats in various group(×400)

IUA 的病因是由于宫腔操作或宫腔感染引起子宫内膜基底层受损和成纤维细胞增生，导致宫腔部分或全部黏连。目前对IUA 的研究常用刮宫法建立IUA 大鼠模型。张永裕等［8］采用刮宫加感染多重损伤法建立IUA 大鼠模型，结果显示：IUA 模型大鼠子宫内膜组织中LIF 和整合素αVβ3 水平均明显降低，提示该方法建立IUA 模型能够降低大鼠子宫内膜容受性。本研究中HE 染色和Masson染色结果显示：模型组大鼠子宫内膜组织坏死，腺体减少，细胞排列紊乱，组织纤维化增生，子宫内膜组织纤维化面积比明显增加，均符合子IUA 的特征［9-10］，IUA 破坏子宫内膜形态结构和功能完整性，从而损伤子宫内膜容受性，降低妊娠率，增加流产风险［11-12］。

表4 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA表达水平Tab.4 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF mRNA in endometrium tissue of rats in various groups

表4 各组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF mRNA表达水平Tab.4 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF mRNA in endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose αVβ3 mRNA 0.813±0.023 0.145±0.019*LIF mRNA 0.794±0.031 0.136±0.015*0.566±0.018△0.617±0.020△#0.650±0.025△#O 0.490±0.021△0.542±0.024△#0.675±0.026△#O

子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎着床的能力，与生育功能及正常妊娠有密切关联［13］。整合素αVβ3 和LIF 是衡量子宫内膜容受性的分子标志物［14-15］。整合素αVβ3 是由αV 和β3 2 个亚基构成的异源二聚体，分泌中期表达水平升高，诱导子宫内膜组织从非黏附状态向黏附状态转变，有利于胚胎着床；相反，整合素αVβ3 在子宫内膜表达水平降低，导致子宫内膜容受性下降［16］。LIF 是一种分泌型糖蛋白，在整个月经周期子宫内膜腔上皮及腺上皮细胞中均有表达，通过激活Janus 激酶/信号转导与转录激活子 （Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK/STAT）途径和RAS 蛋白-有丝分裂原活化蛋白激酶（RASmitogen-activated protein kinase，RAS-MAPK） 途径等信号通路，调控特定基因的转录和蛋白质合成，影响组织细胞的功能活动［17-18］。整合素αVβ3是目前公认最具代表性的反映子宫内膜容受性的黏附分子，其表达水平升高可说明子宫内膜容受性升高［19］。研究［20］表明： LIF 能够上调整合素αVβ3和整合素αVβ5 的表达，从而提高子宫内膜的容受性。本研究结果显示：模型组大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表达水平均明显低于对照组，与有关研究［8，21］结果一致，说明子宫内膜组织受损可引起整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表达水平变化，表明成功建立IUA 大鼠模型；给予丹参酮ⅡA 干预后，IUA 大鼠子宫内膜组织中整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表达水平均明显升高，表明丹参酮ⅡA 可改善子宫内膜容受性，且呈剂量-效应依赖性。

综上所述，丹参酮ⅡA 可通过上调子宫内膜组织中整合素αVβ3 和LIF 的表达，改善子宫内膜容受性，促进子宫内膜修复。