黄建成, 郭世超, 刘璞娟, 董彦博, 李红英,吕 瑛

（河北医科大学第一医院心脏外科，河北 石家庄 050031）

先天性心脏病是婴幼儿最常见的先天性畸形，也是造成婴幼儿死亡的主要病因，缺血缺氧是先天性心脏病患儿的病理生理过程，在缺血缺氧过程中，心肌细胞将产生一系列适应性改变。心肌细胞凋亡是缺血缺氧心肌损伤的主要形式，其发生受多种基因表达的调控，其中B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 关X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，caspase-3） 与 细 胞 凋 亡 有 密 切 关联［1-2］。西红花苷（Crocin） 是西红花的有效成分之一，具有降血压、降血脂和抗动脉粥样硬化等药理作用［3-5］。近年来研究［6-7］表明：西红花能够减轻氧化损伤，改善微循环，对缺血缺氧心肌有一定保护作用。目前尚未发现西红花提取物西红花苷对缺血缺氧心肌作用方面的相关研究。本研究建立缺血缺氧心肌损伤大鼠模型，采用不同剂量西红花苷进行干预，通过观察大鼠心肌组织病理形态表现，心肌细胞凋亡情况，心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表达水平以及血清中氧化相关损伤因子的变化，探讨西红花苷对缺血缺氧心肌损伤的保护作用及其可能机制，为缺血缺氧心肌损伤的临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器SPF 级SD 大鼠50 只，雄性，4 周龄，体质量（280±20）g，购自于河北以岭医药研究院有限公司，动物使用许可证号：SYXK（冀）2015-0064。实验前适应性饲养1 周，实验期间自由摄食和饮水。BCA 蛋白试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司，西红花苷（纯度98%） 购自南京景竹生物科技有限公司，兔抗鼠Bcl-2、兔抗鼠Bax、兔抗鼠caspase-3 和山羊抗兔IgG 二抗购自美国Santa Cruz 公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）、 乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH） 和 肌 酸 激 酶（creatine kinase，CK）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。PSM11R-090 型电子天平（德国梅特勒-托利多公司），YD-1508R 型石蜡切片机（郑州南北仪器设备有限公司），蛋白电泳转移系统（美国Bio-Rad 公司），9700 型PCR 扩增仪（美国ABI公司）。

1.2 实验动物分组及模型建立50 只SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量西红花苷组、中剂量西红花苷组和高剂量西红花苷组，每组10 只。假手术组和模型组大鼠给予0.9%生理盐水灌胃，低、中和高剂量西红花苷组分别灌胃给予20、40 和80 mg·kg－1西红花苷，每天1 次，连续5 d［8］。最后一次灌胃给药结束后1 h，进行模型建立。腹腔注射10%水合氯醛300 mg·kg－1将大鼠麻醉后，仰卧固定，于左胸3-4 肋间切皮，钝性分离，暴露心脏，打开心包，找到左冠状动脉前降支（left anterior descending，LAD），将无损伤缝合线于LAD 下穿过，完成打结。缺血成功标准：肉眼可见结扎线下心脏左室壁变暗变紫，心尖部变白，心电图示心肌缺血，缺血30 min 后，剪断结扎线，恢复心肌供血，恢复灌注120 min；再灌注成功标准：左心室和心尖部变红润。待大鼠苏醒后撤除呼吸插管，恢复自主呼吸，再灌注8 h 后取材。假手术组大鼠只穿线不结扎，其他操作相同。

1.3 HE 染色观察大鼠心肌组织病理形态表现实验结束后处死大鼠，取大鼠心肌组织，液氮冷冻，采用10%的甲醛浸泡固定，沿左室长轴的中点行组织切片，厚度为4 μ m，清洗，苏木精染色5 min，清洗，置入含1% HCl 的无水乙醇中固定，用伊红染色4 min，清洗，无水乙醇固定后石蜡包埋，置于光学显微镜下400 倍放大倍数观察大鼠心肌组织病理形态表现。

1.4 原位末端标记（TUNEL）法检测大鼠心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）实验结束后处死大鼠，取大鼠心脏，分离心尖部位心肌组织，采用4%多聚甲醛固定12 h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，冰冻切片，厚度为4 μm，脱蜡至水，进行TUNEL 染色，具体步骤：PBS 缓冲液洗涤3 次后，蛋白激酶K 工作液处理15 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，加入3% H2O2处理5 min 阻断内源性过氧化物酶活性，PBS 缓冲液洗涤3 次，加入含0.1% Triton X-100 的0.1%枸橼酸溶液去除细胞膜表面污物，PBS 缓冲液洗涤3 次。加入TUNEL 反应液，于37 ℃避光孵育1 h，加DAPI，37℃避光孵育1 h，PBS 缓冲液洗涤3 次，用抗荧光淬灭封片液，封片后置于荧光显微镜下观察，TUNEL 显示绿色荧光，DAPI 显示蓝色荧光。每张切片随机选取5 个视野，于400 倍显微镜下计数凋亡细胞，计算心肌细胞AI，AI=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 RT-PCR 法检测大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 表达水平取大鼠心尖部位心肌组织，采用异硫氰酸胍法提取组织总RNA，紫外分光光度计260/280 nm 处检测RNA 浓度，在甲醛-MOPS 凝胶电泳缓冲液中1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 质量。反应条件：25 ℃、10 min；42 ℃、60 min；85 ℃、5 min；终止反应，冰浴5 min。Bax、Bcl-2 和caspase-3 引 物 均 根 据 标 准RT-PCR 引物设计原则，由上海瑞晶生物工程有限公司设计并合成。引物序列：Bcl-2，上游引物5′-GTGAACTGGGGGAGGAT-TGT-3′，下 游 引 物5′-GCATCCCAGCCTCCG-TTA-3′，167 bp；Bax，上 游 引 物 5′-CCCGAGAGGTCTTCTTCCG-3′，下 游 引 物5′-GAAGTCCAGTGTCCAGCC CA-3′，167 bp； caspase-3，上 游 引 物5′-CGAAACTCTTCATCATTCAGGC-3′ ，下游引物5′-AGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-3′，129 bp；β-actin，上 游 引 物5′-CCCATCTATGAG-GGTTACGC-3′，下 游 引 物5′-TTTAATGTCA-CGCACGATTTC-3′，150 bp。扩增条件：94 ℃、 4 min；94 ℃、20 s，60 ℃、 30 s，72 ℃、30 s ，循环35 次；72 ℃检测信号。以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值表示目的基因mRNA 表达水平。

1.6 Western blotting 法检测大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表达水平取大鼠心尖部位心肌组织，制成匀浆，离心，收集上层蛋白质抽提物，采用BCA 蛋白试剂盒定量。组织蛋白用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至聚偏氟乙烯膜。采用5%无脂牛奶封闭1 h，TTBS 缓冲液处理5 min，转膜，分别加入Bcl-2（1∶500）、Bax （1∶500） 和 活 化 型caspase-3（1∶500） 一抗，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000），37 ℃孵育45 min。增强化学发光反应，定量分析。内参抗体为β-actin。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.7 ELISA 法检测大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性造模8 h 后，大鼠断头取血，静置15 min后，3 000 r·min－1离心分离血清，采用试剂盒测定MDA 水平及SOD、LDH 和CK 活性，具体步骤按试剂盒说明书相关指标检测方法进行。

1.8 统计学分析采用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠心肌细胞AI，心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表达水平，血清中MDA 水平及SOD、LDH 和CK 活性，均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态表现假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌间质无炎细胞浸润。模型组大鼠心肌纤维紊乱、出现水肿，心肌间质大量炎细胞浸润。与模型组比较，低剂量西红花苷组大鼠心肌炎细胞浸润和心肌纤维水肿程度减轻；中和高剂量西红花苷组大鼠心肌纤维无明显水肿，心肌细胞胞核大小均匀，少量炎细胞浸润，心肌肌纤维破坏减轻。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态表现（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of myocardium tissue of rats in various group(HE，×400)

2.2 各组大鼠心肌AI与假手术组比较，模型组大鼠心肌AI 明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量西红花苷组大鼠心肌AI 明显降低（P＜0.05）；与低剂量西红花苷组比较，中和高剂量西红花苷组大鼠心肌AI 明显降低（P＜0.05）；与中剂量西红花苷组比较，高剂量西红花苷组大鼠心肌AI 明显降低（P＜0.05）。见图2 和表1。

表1 各组大鼠心肌AITab.1 AI of myocardium of rats in various groups

2.3 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3mRNA表达水平与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量西红花苷组大鼠心肌组织中Bcl-2 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；与低剂量西红花苷组比较，中和高剂量西红花苷组大鼠心肌组织Bcl-2 mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）；与中剂量西红花苷组比较，高剂量西红花苷组大鼠心肌组织中Bcl-2 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA表达水平Tab. 2 Expression levels of Bcl-2, Bax and caspase-3 mRNA in myocardium tissue of rats in various groups

2.4 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量西红花苷组大鼠心肌组织中Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与低剂量西红花苷组比较，中和高剂量西红花苷组大鼠心肌组织Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与中剂量西红花苷组比较，高剂量西红花苷组大鼠心肌组织Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见表3 和图3。

表3 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

图3 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表达电泳图Fig. 3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各组大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性与假手术组比较，模型组大鼠血清中SOD 活 性 明 显 降 低（P＜0.05），MDA 水 平 和LDH 及CK 活性明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量西红花苷组大鼠血清中SOD 活 性 明 显 升 高（P＜0.05），MDA 水 平 和LDH 及CK 活性明显降低（P＜0.05）；各剂量西红花苷组大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及和CK 活性比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性Tab.4 Levels of MDA and activities of SOD, LDH and CK in serum of rats in various groups (n=10,)

表4 各组大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性Tab.4 Levels of MDA and activities of SOD, LDH and CK in serum of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Sham operation Model Crocin Low dose Medium dose High dose MDA[cB/(mol·L－1)]5.98±0.83 16.27±1.84*SOD[λB/(U·mL－1)]48.51±6.21 26.20±5.31*LDH[λB/(U·L－1)]2 576±278 3 546±330*CK[λB/(U·mL－1)]0.52±0.07 1.37±0.18*1.08±0.20△0.95±0.15△0.86±0.14△10.42±1.13△9.20±1.62△7.84±1.31△36.62±3.47△38.49±2.99△42.37±4.03△2 927±213△2 710±227△2 697±194△

3 讨 论

近年来，我国急性心肌梗死的发病率呈升高趋势，具有发病迅速和死亡率高的特点，严重威胁着人们健康［9］。本研究通过结扎左冠状动脉前降支再灌注的方法建立大鼠缺血缺氧心肌损伤模型，具有操作简便、成功率高的特点。本研究中HE 染色结果表明：模型组大鼠心肌纤维紊乱、出现水肿，心肌间质大量炎细胞浸润，与相关研究［10］结果基本一致，说明采用该方法建立大鼠缺血缺氧心肌损伤模型可靠。研究［11-12］表明：心肌细胞凋亡和氧化应激损伤均是缺血缺氧心肌损伤发生发展的重要病理机制。激活型caspase-3 在凋亡诱导信号的作用下，大范围水解细胞内的靶物质，降解细胞内蛋白，在细胞凋亡启动及后续过程中均发挥重要作用［13］。Bcl-2 能够通过抑制caspase-3 激活，起到抑制细胞凋亡的作用［14］。Bax 主要通过破坏线粒体渗透 性，并 激 活caspase-3 促 进 细 胞 凋 亡［15］。Bax 与Bcl-2 聚合成二聚体相互抑制活性，因此Bcl-2 与Bax 比值能反映出二者对细胞凋亡的调控作用［16］。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌AI 明显升高，心肌组织中Bcl-2 表达水平降低，Bax 和caspase-3 表达水平升高，与谭亚芳等［17］研究结果一致，说明心肌缺血缺氧通过降低Bcl-2 表达，提高Bax 和caspase-3 表达，诱发心肌细胞凋亡。心肌细胞损伤后，细胞膜通透性增加，心肌细胞内心肌酶LDH 和CK 释放入血，血清中LDH 和CK 活性可反映心肌坏死量，判断心肌细胞损伤程度［18］。SOD 是 清 除 自 由 基 的 首 要 物 质，MDA 作为脂质过氧化产物，二者通常作为机体清除氧自由基能力和机体脂质过氧化程度的评价指标［19-20］。本研究结果表明：与假手术组比较，模型组大鼠血清中LDH 和CK 活性升高，SOD 活性降低，MDA水平升高，与高维明等［21］研究结果一致，说明大鼠心肌缺血缺氧损伤严重，机体清除氧自由基能力下降，机体脂质过氧化程度加重。

西红花苷是药材西红花的主要成分，研究［22］表明：西红花苷具有显著的心血管保护作用和抗氧化活性。本研究结果表明：低、中和高剂量西红花苷干预后，大鼠心肌AI 降低，心肌组织中Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平升高，Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表达水平明显降低，血清中MDA 水平降低，SOD 活性升高，LDH 和CK 活性降低，与楚溪等［23］研究报道一致，说明西红花苷能够有效抑制细胞凋亡，减轻心肌过氧化程度。

综上所述，西红花苷能通过上调Bcl-2 表达，下调Bax 和caspase-3 表达，抑制再灌注损伤后心肌细胞凋亡，进而缓解心肌组织氧化应激损伤。