王玉虹 夏小军 崔 杰 姜俊峰 段 赟

甘肃省肿瘤医院血液肿瘤科，甘肃兰州 730050

微小残留病灶（minor residual disease，MRD）是导致白血病复发的根本原因，而免疫疗法已成为清除白血病微小病变的主要手段之一。白血病（leukemia）在获得完全缓解后进行免疫治疗可提高疗效[1]。树突状细胞（dendritic cell，DC）是功能最强的抗原提呈细胞，在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的发生过程中，其可弥补AML 细胞的缺陷，产生抗AML特异性的细胞毒性T 淋巴细胞。一些中药作为免疫调节剂，能够促进DC 的成熟，提高其抗肿瘤活性[2]。中药墓头回（Mutouhui，MTH）具有清热解毒、消痈散结之功效，可用于治疗肠道肿瘤、白血病等[3-5]，但MTH免疫治疗白血病的作用机制还不清楚。因此，本研究将MTH 提取物体外作用于AML患者来源的DC，探讨MTH 对促DC 成熟及功能的机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016～2018年甘肃省肿瘤医院血液肿瘤科的15例AML 完全缓解患者，其中男8例，女7例；中位年龄29（15，43）岁；3例M2a，2例M2b，3例M3，1例M4，5例M5，1例M6。研究对象均签署知情同意书，研究程序报甘肃省肿瘤医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 骨髓单个核细胞的分离

抽取AML 完全缓解患者的骨髓10～20 mL（40 U/mL肝素抗凝），使用Ficoll 淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）梯度离心法分离骨髓单核细胞（bone marrow monocytes，BMC），收集BMC 于10 mL 离心管中，离心弃上清，加入含10%灭活胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）的RPMI1640 完全培养基（美国Gibco 公司）重悬细胞，调整密度浓度为5×106/mL。

1.3 树突细胞的培养与MTH 的成熟诱导

将BMC 加入培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养3 h，加入含1000 U/mL 集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）和500 U/mL rh IL-4的RPMI1640 完全培养基继续培养，隔日半量换液。其中1例AML 完全缓解患者BMC 在第6 天时收获未成熟DC，以4×106/mL 密度接种48 孔板（1 mL/孔，共15 孔）。将未成熟DC分为对照组（control）、LPS 组（阳性对照，加入10 μg/mL LPS）、MTH（上海同田生物技术有限公司）多糖组、MTH 皂苷类组、MTH 萜类组，后三组又分0.001、0.010、0.100 μg/mL 亚组，对照组、LPS 组和各亚组分别设三个平行对照；继续培养48 h，观察并收获DC；同时收集培养上清，待测。

1.4 DC 的形态及免疫表型检测

瑞氏-吉姆萨染色DC，倒置显微镜观察DC。将待测细胞调至1×106/mL，取细胞悬液100 μL/管，分别加入15 μL PE 标记鼠抗人单克隆抗体CD1a、CD86 及FITC 标记鼠抗人单克隆抗体HLA-DR、CD80、CD83（购自美国Caltag 公司），混匀后置避光室温下孵育30 min，用PBS 缓冲液洗涤2次，1000 r/min，5 min 离心洗涤后，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪（FACS，美国Becton Dicknson 公司）检测，数据用Cell Quest 软件分析。

1.5 检测DC 的IL-12（p70）分泌

按IL-12（p70）ELISA检测试剂盒（美国Biosource公司）说明书检测DC 上清液中IL-12 的含量，显色后即刻用酶标仪（Wellscan Mk3，美国Labsystems Dragon 公司）在450 nm 波长处检测光密度，根据标准曲线确定IL-12 的含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件（美国IBM 公司）进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用t 检验，不符合正态分布者采用中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，或者经过变量转换为正态分布后行统计学分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTH 对DC 形态的影响

将AML 完全缓解患者BMC 成功诱导为DC。分离的BMC 经培养3 h 后，呈贴壁生长。在培养诱导1 d后，细胞较前略微增大。培养4 d 后，细胞聚集成簇，并向周围伸出细小的树突样伪足。培养第7 天时，多数BMC 细胞已成为DC（图1，封四）。加入MTH 培养2 d后，诱导的DC 发育成熟，悬浮在培养液中，可见细胞体积明显变大，细胞周围有明显的丝状树突样伪足（图1，封四）。

2.2 DC 细胞膜表面标志物的表达

LPS 组、MTH 多糖组和萜类组的表面标志阳性表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；MTH多糖组0.100 μg/mL 亚组各DC 表面标志物的阳性表达率与LPS 组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；MTH萜类组各DC 表面标志物的阳性表达率低于LPS 组，差异有统计学意义（P<0.05）；MTH 皂苷类DC 表面标志物的阳性表达率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但低于LPS 组，差异有统计学意义（P<0.05）；MTH 多糖组0.010 μg/mL 亚组的CD80、CD83、CD1a低于LPS 组，且低于0.100 μg/mL 亚组，差异有统计学意义（P<0.05），MTH 多糖组0.001 μg/mL 亚组的CD80、CD83、CD86、CD1a 低于LPS 组，且低于0.100 μg/mL亚组，差异有统计学意义（P<0.05）；MTH 萜类组0.010 μg/mL亚组的CD86 低于0.100 μg/mL 亚组，0.001 μg/mL 亚组 的CD80、CD83、CD86、CD1a 低 于0.100 μ/mL 亚组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3 MTH 促进DC 分泌IL-12

MTH 多糖、萜类组和LPS 组的促进DC 分泌IL-12水平高于对照组（P<0.05），其中MTH 多糖和萜类组0.100 μg/mL 剂量亚组的分泌IL-12 水平高于0.001和0.010 μg/mL 剂量亚组，差异有统计学意义 （P<0.05）；而皂苷组促进DC 分泌IL-12 不显著，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

3 讨论

墓头回别名脚汗草、摆子草、虎牙草，为败酱属植物异叶败酱或糙叶败酱的根茎和根，性凉，味苦，微酸涩。《神农本草经》记载主治火热、火疮、热毒、疥癣、瘙痒、痈疽、痔疮、瘰疬[6]。MTH 墓头回提取物主要有皂甙、多糖、萜类和挥发油等，其主要化学成分是环烯醚萜类、单环降倍半萜苷类、三萜皂苷类、单萜类龙脑苷、黄酮类等[7]。MTH 对移植性肝癌和艾氏癌具有抑制效应[8]，并对分化型甲状腺癌外周血多态性上皮黏蛋白1 阳性表达细胞具有抑制作用[9]，能抑制U14 移植瘤瘤体血管形成[10]。在MTH 诱导脐血基质细胞形成及分泌GM-CSF 的研究表明，MTH 不仅是强抗癌物质，也是造血祖细胞促进剂[11]。

表1 各组DC 表面标志物的阳性表达率（%，±s）

与对照组比较，*P<0.05；与LPS 组比较，▲P<0.05；与0.100 μg/mL MTH 同组剂量亚组比较，△P<0.05

组别 HLA-DR CD80 CD83 CD86 CD1a对照组LPS MTH 多糖（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 萜类（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 皂苷（μg/mL）0.100 0.010 0.001 20.17±13.36 75.09±13.32*13.43±10.23 70.35±12.24*12.37±11.27 80.14±17.49*19.34±16.21 79.53±21.46*14.03±10.39 74.46±20.67*78.08±15.34*68.34±26.19*57.40±25.21*72.23±15.54*43.19±17.23*▲△35.27±15.67*▲△77.34±26.13*46.17±15.80*▲△33.42±17.08*▲△82.25±17.46*66.57±16.54*53.26±23.15*▲△73.13±16.27*44.51±16.34*▲△35.13±17.54*▲△48.54±17.57*▲40.31±16.22*▲33.40±13.27*▲41.13±17.21*▲33.45±14.27*▲24.44±12.43*▲△43.33±16.18*▲31.17±13.34*▲23.11±11.32*▲△50.15±21.43*▲38.67±14.37*▲△35.17±13.45*▲△45.25±15.12*▲30.51±13.35*▲27.14±10.28*▲△20.18±13.12▲19.35±14.54▲19.12±14.44▲15.45±12.46▲16.09±13.43▲14.09±11.13▲16.37±14.13▲12.77±11.26▲12.46±10.38▲21.34±12.31▲19.26±15.16▲18.42±13.44▲14.49±10.67▲15.21±12.03▲16.45±12.31▲

图2 MTH 各组DC 分泌IL-12 的水平（MTH：μg/mL）

AML 属于髓系造血干细胞恶性肿瘤，由于肿瘤生长T 细胞克隆对AML 不应答及T 细胞的杀伤活性低于AML 细胞增生，当AML 在诱导缓解后进行免疫治疗可减少其复发[12]。已有研究报道，AML 细胞能分泌血管内皮生长因子，抑制DC 的成熟，从而抑制其抗肿瘤效应[13]。DC 作为抗原提呈细胞具有显著抑制肿瘤的生长效应，因此如何激活肿瘤发生过程中DC的功能，是当前肿瘤免疫治疗的研究热点[14-16]。

本研究发现，MTH 多糖、萜类能明显诱导DC 成熟，上调DC 细胞表面标志的表达，刺激DC 分泌高水平的IL-12[17]。IL-12 能增加IFN-γ 的生产和刺激NK细胞、T 细胞的活化，也能增强抗体依赖性细胞毒性对肿瘤细胞的作用[18-20]。DC 表面有Toll 样受体、热休克蛋白等受体；Dectin-1是DC 表面特异性受体，可识别具有β-1，3 与β-1，6 连接的葡聚糖，并与Toll样受体有协同作用[21]。CD80、CD83、CD86 及CD1a 等是DC 细胞表面协同分子，能够刺激CD4+T 淋巴细胞分化为Th1 细胞或Th2 细胞，并协同MHC-Ⅱ分子，发挥免疫调节的作用[22]。本研究显示，MTH 能促进DC细胞表面标志物的CD80、CD83、CD86 及CD1a 表达阳性率上调，进一步活化T 细胞，并促进MHC-Ⅱ分子HLA-DR 的上调，促进抗原递呈。

综上所述，本研究发现MTH 多糖和萜类均可增强DC 的功能，增加IL-12 的产生，但本实验研究仅是体外实验，还需要进一步通过动物实验和临床试验验证MTH 的临床应用价值。