赵文，尹亚丽,2，李世雄,2*，刘燕，刘晶晶，张如秀

1. 青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；2.青海大学/三江源区高寒草地生态教育部重点实验室，青海 西宁 810016；3. 青海省西宁市湟源县畜牧兽医站，青海 湟源 812100

草地是中国重要的陆地生态系统，也是分布最广泛，物种最丰富的植被类型，在涵养水源、水土保持和物质循环等方面发挥着重要作用（肖桐等，2013；Katherine et al.，2019）。高寒草甸是草地生态系统的组成部分，其牧草资源不仅对当地畜牧业和民族经济的发展具有不可代替的作用，也对高寒地区风沙、水蚀、盐碱、内涝、地下水位变化、土壤侵蚀、土地资源的流失等自然灾害的发生具有一定的屏障作用（赵春红等，2013）。近几十年，三江源区高寒草甸发生不同程度的退化，部分草地退化严重，形成黑土滩退化草地（马玉寿等，2002）。国内生态学者长期致力于草地退化研究，并依据退化程度制定了重度退化草地翻耕建植人工草地、中度退化草地免耕补播施肥、轻度退化草地围封禁牧等为主的分类恢复措施（闫晓红等，2020）。其中，免耕补播利用牧草施肥和补播的联合机组作业，通过划破草皮，增加了土壤透水、通气性，促进牧草生长、发育及土壤有机质分解，为植物提供更多营养物质（李小龙等，2020）。同时减轻对原生草地植被的破坏，在草群中补播优质牧草，以提高草地生产力（孙磊等，2009），但草甸退化一经出现，恢复将是一个漫长的过程（张骞等，2019）。

微生物是土壤生态系统的重要组成，参与碳、氮循环，有机化合物分解，能量传输、运送等多种过程，对维持生态系统稳定和可持续性方面有重要的作用（Slaughter et al.，2015）。以Biolog微孔板碳源利用为基础的分析是微生物群落代谢功能多样性的一种简单、快速的方法，对不同环境中微生物群落功能多样性信息具有重要意义（刁婵等，2019）。从微生物的层面探究草地退化及恢复过程中的问题，可清晰明确草地退化及其恢复机理。补播做为一种草地改良措施，其目的主要为增加退化草地植被中的优良牧草；而补播对草地土壤微生物的影响滞后于对植被的影响。张建贵等（2017）研究表明补播+围栏半年的退化高寒草甸比围栏封育的效果更好，能够大幅度提高土壤微生物数量；李晓娜等（2019）研究了补播1年的荒滩地，发现补播显著改善了土壤物理性质，并对土壤微生物群落结构产生影响；姚凤娇等（2015）研究表明，补播草地显著提高了土壤0—10 cm土层中真菌、细菌和放线菌的数量，并随着修复年限的增加而呈现增加趋势。但大多数研究针对的是短周期补播，短期补播可能会对草地生产力和微生物区系产生积极影响，课题组成员研究发现，补播短期内显著提高了中度退化草地的生产力（杨增增等，2018）。然而，补播对中度退化草地是否产生长远的影响仍为未知。本研究选择研究补播较长时间（10 a）的中度退化草地，拟揭示补播年限对中度退化高寒草地的土壤微生物的影响，以期对中度退化草地恢复管理提供一定的数据基础。

1 试验地区与方法

1.1 试验区概况

研究区位于青藏高原腹地的青海省果洛藏族自治州玛沁县大武镇（34°27′56.9″N ，100°13′56.9″W，海拔3740 m左右）。该地区为高原大陆性气候，高寒缺氧，日照时间短，太阳辐射强且昼夜温差大。1967—2017年平均气温在-3.4—3.0 ℃之间，最高气温为 26.6 ℃，最低气温-34.9 ℃，最大温差22.4 ℃，最冷月和最热月平均温度分别为-12.6 ℃和9.7 ℃，全年无绝对无霜期（洪卓华等，2018）。降水集中在5—9月，年降水量513—542 mm，年蒸发量为1160 mm。牧草生长季为 156 d，高寒草甸是该地区主要的草地类型，未退化高寒草甸优势种为高山嵩草（Kobresia pygmeae），主要的伴生种有为垂穗披碱草（Elymus nutans）、美丽风毛菊（Saussurea superba）等。

1.2 试验方法

参照马玉寿等（2008）的退化草地分类标准，2006年在青海省果洛州大武镇用免耕补播联合作业机对中度退化草地进行免耕补播处理。选择适宜草种是保证补播效果的关键。本课题组经多年驯化选育的根茎型乡土草种——青海草地早熟禾（Poa pratensisL.）不仅具有适口性好、耐牧的特点，同时可快速形成草皮层，是高寒地区退化草地快速恢复的优良牧草（杨慧茹，2012）。研究表明补播早熟禾第二年的草地植被盖度、生物量、禾草的比例显著增加（李苗，2016）。因此，选择优质禾草青海草地早熟禾为补播草种，播种量 3.75 kg·hm-2；并施用尿素（150 kg·hm-2），补播总面积约20 hm2。自补播后未进行后续改良，返青期（4—6月）完全禁牧，冬季放牧利用（每年12月至次年4月）。

2017年8月，选择补播10年及相邻的未补播的中度退化草地各10 hm2（表1）作为试验样地，在补播草地及未补播草地（对照）各选择植被均匀、具有代表性的区域设置10 m×20 m试验小区，小区间隔100 m，4次重复。在每小区随机选取4个面积为50 cm×50 cm的样方，对植被群落特征进行调查。采用蛇形取样法，以直径3.5 cm的土钻在各小区采集0—10 cm和10—20 cm土样，每小区5—8钻分层混合为1个土样，过2 mm筛，捡除枯物、石粒及植物根系等，封装在自封袋，夹棉塞，冰盒取回4 ℃保存，一周内分析测试微生物生物量碳、氮、群落多样性及碳源利用（党雯等，2015）。

1.3 微生物群落多样性分析方法

采用Biolog-Eco分析土壤微生物6类碳源利用能力。

（1）AWCD为平均每孔颜色变化率（average well change devolopment），是表征土壤微生物活性和多样性的一个重要指标，其值可以反映微生物对单一碳源的利用能力，计算式为（金映虹等，2017）：

式中，C为31孔反映孔在590 nm下的吸光值；R为对照孔吸光值；n为碳源种类数31；C-R的值均大于或等于0，C-R小于0的计算中将其记为0。

（2）选择Shannon多样性指数（H指数）估算群落多样性：

式中，Pi为每个孔吸光度/所有吸光度之和。

（3）Simpson优势度指数（D指数），反映了群落中最常见的物种，可评估微生物群落优势度：

式中，Pi为每个孔吸光度/所有吸光度之和。

表1 试验样地Table 1 Introduction of test site

1.4 数据处理

运用Microsoft Excel 2013进行数据整理；运用SPSS 20.0对各个试验小区的植被地上、地下生物量、微生物生物量及微生物多样性指数进行独立样本t检验，显著水平α=0.05，表中的数据均为平均值±标准差；运用SigmaPlot 14.0作图。

2 结果分析

2.1 补播草地植被生物量变化特征

对补播 10年后和中度退化草地植被地上、地下生物量进行分析，补播 10年后和中度退化草地植被地下生物量分别为 19.61 kg·m-3和 20.12 kg·m-3，地上生物量分别为 200.95 g·m-2和 136.05 g·m-2，但是在95%置信区间补播10年后和中度退化草地间均无显著差异（P＞0.05）（图1）。

2.2 土壤微生物量特征

对补播 10年和中度退化草地不同土层土壤微生物量碳、氮进行分析，0—10 cm土层的微生物量碳、氮均高于10—20 cm土层（图2），即0—20 cm的土层中，75%以上的土壤微生物分布在0—10 cm土层中。而微生物量氮在0—10 cm和10—20 cm表现为补播 10年草地显著高于中度退化草地（P＜0.05）；微生物量碳在0—10 cm和10—20 cm土层均表现为补播 10年草地最高，但与中度退化草地无显著差异（P＞0.05）。

2.3 土壤微生物群落多样性

研究发现，0—10 cm和10—20 cm土层补播10年草地AWCD大于中度退化草地（图3），微生物碳源利用率随培养时间逐渐升高。0—10 cm土层补播10年和中度退化在培养1—4 d，AWCD增长迅速，4 d后增长速率变缓。独立样本t检验分析显示，培养第7天补播10年和中度退化草地AWCD无显著差异（P＞0.05）（表2）。10—20 cm土层中中度退化和补播 10年草地的碳源利用率随时间呈现线性增长，且培养第7天时补播10年草地AWCD显著高于中度退化草地（P＜0.05）。

图1 草地植被地上（Ba）、地下生物量（Bu）Fig. 1 Effects of reseeding on above (Ba) and underground (Bu) biomass of degraded grassland vegetation

图2 土壤微生物生物量碳、氮的分布特征Fig. 2 Distribution characteristics of soil microbial biomass carbon and nitrogen

图3 土壤微生物平均颜色变化率（AWCD）Fig. 3 Average color change rate of soil microorganisms (AWCD)

表2 培养第7天土壤微生物多样性指数Table 2 Soil microbial diversity index at day 7 of cultivation

对补播10年草地和中度退化草地的H和D进行分析（图4），0—10 cm和10—20 cm的土层补播10年草地H和D略高于中度退化草地，且H和D随培养时间逐渐升高。0—10 cm土层中补播10年和中度退化草地的H指数在培养1—3 d增长迅速，培养3 d后增长速率变缓，培养5 d趋于平缓，培养7 d两处理无显著差异（P＞0.05）（表2）；10—20 cm的土层中补播10年和中度退化草地H指数在培养1—3 d增长较为迅速，培养3 d后增长速率变缓，且培养7 d补播10年草地显著高于中度退化草地（P＜0.05）。0—10 cm土层中补播10年和中度退化草地D指数在培养1—3 d增长迅速，培养 3 d趋于平缓，培养 7 d两处理无显著差异（P＞0.05）；10—20 cm土层中补播10年和中度退化草地D指数在培养1—2 d增长迅速，培养2 d后增长速率变缓并趋于平衡，培养7 d两处理无显著差异（P＜0.05）。

2.4 土壤微生物对6类碳源利用能力分析

图4 土壤微生物Shannon指数（H）及Simpson指数（D）Fig. 4 Shannon (H) and Simpson index (D) of soil microorganisms

图5 草地土壤微生物对6类碳源利用率Fig. 5 Utilization rate of 6 types of carbon sources by soil microorganisms

培养7 d，中度退化草地和补播10年草地6大类碳源利用能力表现差异（图5）。0—10 cm中度退化草地土壤碳源利用表现为氨基酸＞单糖类＞胺类＞酯类＞酸类＞醇类的利用，补播 10年草地单糖类＞氨基酸＞酯类＞胺类＞醇类＞酸类，其中补播 10年草地单糖利用占比显著高于中度退化草地；其他碳源利用变化差异不显著。10—20 cm中度退化草地中碳源利用表现为氨基酸＞胺类＞酯类＞单糖＞酸类＞醇类，补播10年后草地氨基酸＞酯类＞胺类＞酸类＞醇类＞单糖，其中单糖和酯类利用占比差异显著，补播 10年草地单糖利用占比显著高于中度退化草地，而酯类显著低于中度退化草地。

2.5 微生物对六类碳源利用特征分析

本试验选取补播10年和中度退化草地0—10 cm土层作进一步的碳源选择利用分析。补播 10年草地碳源利用数据提取2个主成分，累计贡献率达到93.41%，其中第一轴主成分（PCA1）方差贡献率为66.83%，第二主成分（PCA2）的方差贡献率为26.58%（图6A）；而中度退化草地第一、二累计方差贡献为97.87%（图6B），这说明未退化草地对碳源选择利用较集中和稳定。六类碳源的主成分矩阵显示（表 3、4），不同处理微生物群落在两个培养期对碳源选择利用以氨基酸类为主导碳源。

表3 补播10年草地0—10 cm土壤微生物对6类碳源利用主成分矩阵Table 3 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland after 10 years of reseeding

表4 未补播草地0—10 cm土壤微生物对6类碳源的主成分矩阵Table 4 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland of never reseeded

2.6 补播草地土壤微生物生物量与群落多样性的相关性分析

土壤微生物平均颜色变化率（AWCD）与微生物生物量碳呈极显著正相关（P＜0.01）（表 5），与微生物生物量氮呈极显著正相关（P＜0.05）；多样性H和D指数与微生物生物量碳、氮都呈现出极显著正相关（P＜0.01），其中微生物量氮与多样性D指数相关系数最大。

图6 中度退化（A）、补播10年草地（B）微生物对6类碳源代谢的主成分图Fig. 6 Principal component analysis of 6 types of carbon sources by microorganisms in moderately degraded grassland (A) and grassland after 10 years of reseeding (B)

表5 土壤微生物AWCD、H指数、D指数和微生物生物量碳、氮相关系数Table 5 Correlation coefficients of soil microorganism AWCD, H index and D index with microbial biomass carbon, nitrogen

3 讨论

补播以近自然的措施在短期内显著提高草地生产力，石锋（2009）对草地碳库研究指出，补播会显著影响草地碳库，具体表现在对土壤质量的改善和地上生物量的增加。本研究发现在中度退化高寒草甸补播青海草地早熟禾 10年对植被地上、下生物量无显著影响（P＞0.05），这可能与补播周期有关，补播初期新增加的物种还未得到完全生长，有些种子还处于萌发的状态，随着补播年限的增加，草地生产力达到最大值，之后随着管理水平等的降低草地生产力会逐渐降低。另一方面，补播草地不同于天然草地，其生态和生产功能难以长时间维持平衡，同时补播使禾草增加，影响了原生植被种间竞争关系，使得总物种数减少，草地可食牧草比例增加（陈子萱等，2011）。有研究指出补播 2年后植被地上生物量显著高于退化草地（孙磊等，2012），2—4年内补播草地的地上生物量会达到最大（李希来等，2018），而此后由于环境因素和种间竞争等关系复杂，群落可能出现演替不确定性。

微生物生物量被称为活的有机质，其大小是判定土壤肥力高低及其变化的重要依据，可作为非稳定性有机碳的指示器反映有效养分的状况和生物活性的变化（Rui et al.，2011）。本研究发现，补播10年后，微生物量碳与未补播草地无显著差异，表明补播 10年后补播措施的影响基本消失。补播后微生物的数量及其多样性可能是短期内增加（3—5年），随着管理水平等措施的下降微生物区系也出现下降的趋势。姬万忠等（2016）在天祝对补播3年的退化高寒草甸的研究发现，与没有补播的草地相比，补播草地土壤微生物量C和N分别增加了23.50%和50.78%，说明补播初期对退化草地土壤微生物有一定的影响。邵建飞（2009）研究指出，补播3年的草地土壤微生物生物量C、N含量显著高于补播6年草地，建议3—4年后再次进行补播。因此补播草地的微生物生物量在 1—3年是增加的趋势，但是随着补播年限的增加补播影响会减弱甚至消失。

微生物群落的 AWCD既反映了微生物对碳源的整体利用水平，也可以衡量31种碳源利用程度，能够简便分析出微生物群落碳源利用的动力学特征（陈喜蓉等，2017）。本研究中补播和中度退化草地 AWCD均随培养时间呈缓慢上升趋势。这说明试验样地缺乏有效的碳源营养物质，样地整体呈现退化的状态，微生物群落处于较低代谢活力的状态（冯海玮等，2016），单一碳源就能够激发处理土样中微生物代谢活力，并慢慢趋于平缓。而本研究的主要目的是比较分析补播和中度退化草地的微生物，补播和中度退化草地0—10 cm土壤微生物对碳源利用能力差异不显著，补播 10年后对中度退化草地土壤微生物区系的扰动影响基本消失。相关性分析显示AWCD与微生物生物量C、N极显著正相关，说明环境中碳源越丰度越有利于土壤微生物生物量的积累，土壤微生物碳氮磷存在明显的“Redfield Ratio”效应，即土壤微生物生物量的化学计量比是严格定义的，微生物生物量养分比率存在动态平衡控制（Cory et al.，2007），土壤微生物通过调节自身生理特性来应对环境变化（Allison et al.，2010），即微生物生物量C∶N达到一定的比例后才能进行碳氮的转化循环。H和D指数用来估算种群多样性高低和微生物群落的优势度（柳炳俊等，2020）。本研究中补播草地的微生物多样性和均匀度均高于中度退化草地，但差异并不显著（P＞0.05），尤其是0—10 cm土层未表现任何差异，而微生物的80%集中在近表层（0—10 cm土层）（赵文等，2020）。总体上，微生物的区系并没有在补播10年后发生改变，这与陈子萱等（2011）的研究一致，认为补播只是改良措施的一种，不会对草地的退化有本质的改变，也不能使得退化草地得到恢复或逆向演替，只是一种短期内提高草地生产力的措施。同时土壤碳源是影响土壤微生物群落动态的重要因素，可根据土壤微生物对不同类型碳源的相对利用程度，反映微生物的代谢功能类群（张红等，2014；赵轻舟等，2018）。本研究碳源利用显示，中度退化草地补播后碳源利用发生改变，单个碳源利用能力在两草地间无显著差异（P＞0.05），进一步碳源利用主成分分析显示，补播和中度退化草地近表层土壤微生物主要利用氨基酸类碳源，进一步说明补播10年后，补播效果逐渐消失。

4 结论

在中度退化草地进行补播恢复措施，发现补播10年后草地的植被上和地下生物量、微生物生物量碳、土壤微生物多样性指数AWCD、H指数、D指数和碳源利用能力与未补播草地差异不显著（P＞0.05）。即补播10年后草地与未补播草地基本一致，补播效果消失。